A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的天然免疫逃避機(jī)制研究.pdf

1、A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)感染人會(huì)誘發(fā)宿主的天然免疫應(yīng)答，通過(guò)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和RIG-I樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)等模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)介導(dǎo)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，刺激下游干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，IS

2、Gs)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒作用。IAV在與宿主的共同進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)展出多種免疫逃避機(jī)制以躲避宿主的免疫應(yīng)答。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(Non-structural protein1，NS1)是流感病毒免疫逃避最重要的蛋白，可通過(guò)結(jié)合病毒dsRNA、靶向RIG-I及E3泛素酶TRIM25和Riplet、抑制抗病毒ISGs活性和宿主細(xì)胞mRNA的加工等方式抑制宿主的IFN應(yīng)答。近年來(lái)，在NS1拮抗宿主免疫應(yīng)答機(jī)制方面取得眾多進(jìn)展，但是仍有許多問(wèn)題

3、沒(méi)有準(zhǔn)確答案，值得深入研究。
　　本研究將H5N1/HM流感病毒NS1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分段，探討其N(xiāo)端RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domain，RBD)和C端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Effector domain，ED)在拮抗RIG-I信號(hào)通路中發(fā)揮的作用，內(nèi)容如下:
　　1.H5N1NS1蛋白的C端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域抑制RIG-I介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
　　將NS1截短為N端的1-73aa和1-125aa以及C端的74-

4、225aa和126-225aa，在不同刺激條件下，考察截短體對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響。在RIG-I或RIG-I(N)刺激下，NS1/74-225和NS1/126-225與全長(zhǎng)NS1顯著抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，而NS1/1-73和NSl/1-125沒(méi)有抑制作用;但是在病毒或dsRNA刺激下，所有截短體都抑制IFN-β啟動(dòng)子的激活，說(shuō)明NS1-RBD抑制IFN依賴(lài)于RNA，而NS1-ED能以RNA結(jié)合非依賴(lài)的方式抑制IFN應(yīng)答。隨后通

5、過(guò)檢測(cè)NS1/126-225對(duì)RIG-I(N)介導(dǎo)的IRF3磷酸化、IRF3二聚體的形成和IRF3入核以及對(duì)IFN-β分泌的影響，進(jìn)一步確認(rèn)了C端效應(yīng)區(qū)NS1/126-225抑制IFN-β產(chǎn)生的效應(yīng)。
　　2.NS1/126-225靶向TRAF3阻礙MAVS-TRAF3復(fù)合物的形成
　　我們推測(cè)NS1/126-225可能作用于RIG-I信號(hào)通路的某個(gè)環(huán)節(jié)，通過(guò)IFN-β啟動(dòng)子報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、熒光定量PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)證明了

6、NS1/126-225抑制IFN-β產(chǎn)生位于MAVS和TBK1之間。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，NS1/126-225與TRAF3存在相互作用，NS1也能結(jié)合TRAF3，并在H5N1/HM病毒感染的A549細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞和鼠原代巨噬細(xì)胞中驗(yàn)證了NSI與內(nèi)源性的TRAF3存在相互作用，但是這種相互作用具有毒株特異性。在TRAF3敲低的細(xì)胞中，NS1/126-225對(duì)RIG-I(N)介導(dǎo)的IRF3磷酸化和IFN-β轉(zhuǎn)錄的抑制作用喪失，進(jìn)一

7、步證明TRAF3是NS1/126-225抑制IFN產(chǎn)生必需的。更深的分子細(xì)節(jié)是NS1/126-225與TRAF3的TRAF domain結(jié)合，阻礙TRAF3-MAVS復(fù)合物的形成。此外，NS1/126-225還能促進(jìn)SeV感染早期MAVS對(duì)IKKε的招募，最終抑制RIG-I信號(hào)通路激活和細(xì)胞抗病毒應(yīng)答。
　　3.NS1/126-225抑制TRAF3的K63泛素化
　　本研究還發(fā)現(xiàn)NS1/126-225能抑制TRAF3的K63

8、泛素化。因其本身沒(méi)有調(diào)節(jié)蛋白泛素化修飾改變的能力，NS1/126-225可能通過(guò)招募去泛素酶來(lái)切割TRAF3上的K63泛素鏈或抑制E3泛素酶結(jié)合到TRAF3。DDX3是一種RNA解旋酶，能促進(jìn)TRAF3的K63泛素化并且能與NS1發(fā)生相互作用。在沉默DDX3后，NS1/126-225仍然抑制TRAF3的泛素化，但是病毒感染下對(duì)TRAF3泛素化的抑制作用不顯著，說(shuō)明NS1利用DDX3抑制了TRAF3的K63泛素化。
　　4.NS1突

9、變的病毒HM-Mut誘導(dǎo)高水平的IFN-β產(chǎn)生
　　NS1缺失126-225位氨基酸的突變病毒HM-Mut與野生型病毒相比在A549細(xì)胞的復(fù)制能力顯著下降，誘導(dǎo)IFN-β和ISGs的能力則顯著增強(qiáng)。此外，我們發(fā)現(xiàn)PR8病毒編碼的NS1N端截短體tNS1能與TRAF3相互作用，抑制IFN-β和ISG表達(dá)。沉默TRAF3后，突變病毒PR8/M79.81I拮抗IFN的能力以及復(fù)制能力與野生型病毒沒(méi)有顯著差異，這一結(jié)果很好的補(bǔ)充了本研究的