A型流感病毒NS1蛋白效應結構域介導的天然免疫逃避機制研究.pdf

1、A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)感染人會誘發(fā)宿主的天然免疫應答，通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和RIG-I樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)等模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)介導的信號通路，誘導Ⅰ型干擾素和其他細胞因子的產生，刺激下游干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，IS

2、Gs)的表達，從而發(fā)揮抗病毒作用。IAV在與宿主的共同進化過程中，發(fā)展出多種免疫逃避機制以躲避宿主的免疫應答。非結構蛋白NS1(Non-structural protein1，NS1)是流感病毒免疫逃避最重要的蛋白，可通過結合病毒dsRNA、靶向RIG-I及E3泛素酶TRIM25和Riplet、抑制抗病毒ISGs活性和宿主細胞mRNA的加工等方式抑制宿主的IFN應答。近年來，在NS1拮抗宿主免疫應答機制方面取得眾多進展，但是仍有許多問題

3、沒有準確答案，值得深入研究。
　　本研究將H5N1/HM流感病毒NS1蛋白的功能結構域進行分段，探討其N端RNA結合結構域(RNA-binding domain，RBD)和C端效應結構域(Effector domain，ED)在拮抗RIG-I信號通路中發(fā)揮的作用，內容如下:
　　1.H5N1NS1蛋白的C端效應結構域抑制RIG-I介導的IFN-β產生
　　將NS1截短為N端的1-73aa和1-125aa以及C端的74-

4、225aa和126-225aa，在不同刺激條件下，考察截短體對IFN-β啟動子活性的影響。在RIG-I或RIG-I(N)刺激下，NS1/74-225和NS1/126-225與全長NS1顯著抑制IFN-β啟動子活性，而NS1/1-73和NSl/1-125沒有抑制作用;但是在病毒或dsRNA刺激下，所有截短體都抑制IFN-β啟動子的激活，說明NS1-RBD抑制IFN依賴于RNA，而NS1-ED能以RNA結合非依賴的方式抑制IFN應答。隨后通

5、過檢測NS1/126-225對RIG-I(N)介導的IRF3磷酸化、IRF3二聚體的形成和IRF3入核以及對IFN-β分泌的影響，進一步確認了C端效應區(qū)NS1/126-225抑制IFN-β產生的效應。
　　2.NS1/126-225靶向TRAF3阻礙MAVS-TRAF3復合物的形成
　　我們推測NS1/126-225可能作用于RIG-I信號通路的某個環(huán)節(jié)，通過IFN-β啟動子報告基因實驗、熒光定量PCR和ELISA實驗證明了

6、NS1/126-225抑制IFN-β產生位于MAVS和TBK1之間。Co-IP實驗表明，NS1/126-225與TRAF3存在相互作用，NS1也能結合TRAF3，并在H5N1/HM病毒感染的A549細胞、HEK293T細胞和鼠原代巨噬細胞中驗證了NSI與內源性的TRAF3存在相互作用，但是這種相互作用具有毒株特異性。在TRAF3敲低的細胞中，NS1/126-225對RIG-I(N)介導的IRF3磷酸化和IFN-β轉錄的抑制作用喪失，進一

7、步證明TRAF3是NS1/126-225抑制IFN產生必需的。更深的分子細節(jié)是NS1/126-225與TRAF3的TRAF domain結合，阻礙TRAF3-MAVS復合物的形成。此外，NS1/126-225還能促進SeV感染早期MAVS對IKKε的招募，最終抑制RIG-I信號通路激活和細胞抗病毒應答。
　　3.NS1/126-225抑制TRAF3的K63泛素化
　　本研究還發(fā)現(xiàn)NS1/126-225能抑制TRAF3的K63

8、泛素化。因其本身沒有調節(jié)蛋白泛素化修飾改變的能力，NS1/126-225可能通過招募去泛素酶來切割TRAF3上的K63泛素鏈或抑制E3泛素酶結合到TRAF3。DDX3是一種RNA解旋酶，能促進TRAF3的K63泛素化并且能與NS1發(fā)生相互作用。在沉默DDX3后，NS1/126-225仍然抑制TRAF3的泛素化，但是病毒感染下對TRAF3泛素化的抑制作用不顯著，說明NS1利用DDX3抑制了TRAF3的K63泛素化。
　　4.NS1突

9、變的病毒HM-Mut誘導高水平的IFN-β產生
　　NS1缺失126-225位氨基酸的突變病毒HM-Mut與野生型病毒相比在A549細胞的復制能力顯著下降，誘導IFN-β和ISGs的能力則顯著增強。此外，我們發(fā)現(xiàn)PR8病毒編碼的NS1N端截短體tNS1能與TRAF3相互作用，抑制IFN-β和ISG表達。沉默TRAF3后，突變病毒PR8/M79.81I拮抗IFN的能力以及復制能力與野生型病毒沒有顯著差異，這一結果很好的補充了本研究的