基于三維培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞PC-3大規(guī)模生產(chǎn)的研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞小規(guī)模體外二維到三維靜止培養(yǎng)條件的逐步優(yōu)化，后在wave20/50生物反應(yīng)器中利用2L-cell-bag和微載體cytodex3對(duì)PC-3細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過程中的擺動(dòng)方式和營(yíng)養(yǎng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化，從而建立了一個(gè)適合PC-3細(xì)胞在波浪式生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)的新型平臺(tái)，為今后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和腫瘤細(xì)胞疫苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.PC-3細(xì)胞二維靜止培養(yǎng)的條件優(yōu)化:

2、r>　　在二維培養(yǎng)皿中利用24孔板對(duì)PC-3細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特性，種子細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從文獻(xiàn)查閱常用的四種培養(yǎng)基中選出PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)最好，達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)間最短，生長(zhǎng)密度最高的培養(yǎng)基，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，用血球計(jì)數(shù)板繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　2.PC-3細(xì)胞三維靜態(tài)培養(yǎng)的條件優(yōu)化:
　　在10cm細(xì)菌培養(yǎng)皿中對(duì)微載體的初始接種密度，細(xì)胞的初始接神密度，微載體的類型cytodex1和cytodex3，血清濃度，

3、培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)方式，新舊球的加入比例等條件的優(yōu)化，使用細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析細(xì)胞生長(zhǎng)活力，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的貼壁和生長(zhǎng)狀態(tài)，用0.1％結(jié)晶紫檸檬酸染液對(duì)細(xì)胞核染色并繪制生長(zhǎng)曲線，用葡萄糖和乳酸試劑盒，對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝情況在酶標(biāo)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
　　3.PC-3細(xì)胞三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的條件優(yōu)化:
　　在wave20/50生物反應(yīng)器中利用2L-cell-bag，設(shè)定5％CO237℃，0.01通氣流速的情況下，對(duì)PC-3細(xì)胞在小規(guī)

4、模三維靜止的條件基礎(chǔ)上分別采取全擺動(dòng)，不擺動(dòng)，間隙擺動(dòng)的培養(yǎng)方式在wave20/50生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，考察了培養(yǎng)基中不同起始血清濃度對(duì)PC-3細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)的影響;營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖）的補(bǔ)充對(duì)PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;通過繪制生長(zhǎng)曲線和觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，監(jiān)測(cè)葡萄糖和乳酸代謝情況，收獲細(xì)胞數(shù)等參數(shù)進(jìn)行最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化。
　　采用流式細(xì)胞分析儀對(duì)微載體培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞膜表面生物素化和hGM-CSF蛋白的修飾功能進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)

5、果：
　　1.在二維靜止培養(yǎng)方式中，使用了四種含10％FBS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，其中選取含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為種子細(xì)胞培養(yǎng)基，其PC-3細(xì)胞的分泌顆粒物最少，細(xì)胞形態(tài)呈飽滿梭形，細(xì)胞內(nèi)空泡較少，細(xì)胞老化速度慢，最大細(xì)胞密度達(dá)到1.26x106cell/ml，固選為種子培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　2.在3D靜止培養(yǎng)體系，我們選擇以3g/l cytodex3和2x105cell/ml細(xì)胞密度的接種

6、條件，比較了不同起始血清濃度(10％，5％，2％，0％FBS)對(duì)PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響，血清濃度和細(xì)胞的最大密度成正相關(guān);隨后比較了雙相血清濃度培養(yǎng)方法，其中起始血清濃度為10％ RPMI1640待細(xì)胞貼壁后將血清濃度降至5％與全程使用10％FBS培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線基本相似，相對(duì)于全程使用5％FBS的培養(yǎng)基細(xì)胞密度分別提高了1.7和1.64倍。
　　3.PC-3細(xì)胞在cytodex3靜止的培養(yǎng)條件下，在10cm2細(xì)菌培養(yǎng)皿中對(duì)其貼

7、滿載體的細(xì)胞進(jìn)行不消化直接接種新舊球比例為1∶1-2∶1時(shí)，細(xì)胞可以通過“僑聯(lián)”的作用貼滿新球，在模擬細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)體系中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行每天半量換液的操作，建立了一種小規(guī)模模擬球轉(zhuǎn)球傳代的培養(yǎng)方式，為后期PC-3細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)大培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
　　4.在3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式中，使用微載體3g/l cytodex3和2x105cell/ml細(xì)胞密度的接種條件下，利用wave20/50生物反應(yīng)器在2L細(xì)胞培養(yǎng)袋500ml的培養(yǎng)體積中，結(jié)合氣

8、體和溫度易于控制，在波浪式生物反應(yīng)器中采取靜止——間隔——連續(xù)擺動(dòng)的培養(yǎng)方式（待細(xì)胞在微載體貼壁后逐步提高轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間，擺動(dòng)角度為5°6-9rpm范圍內(nèi)，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣傳遞率的擴(kuò)散），最終收獲細(xì)胞為5.3x108cells，相對(duì)于靜止培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)分別提高了1.42和2.54倍，建立了一種適合wave20/50生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞的平臺(tái)。
　　5.在wave20/50生物反應(yīng)器微載體1L培養(yǎng)體系中，在每天50％換的培養(yǎng)基

9、中補(bǔ)充1g/l的葡萄糖，血清濃度降到2％的條件下，相對(duì)于不添加葡萄糖的培養(yǎng)基，細(xì)胞在微載體上的貼壁時(shí)間更久，細(xì)胞在微載體上伸展的形態(tài)更好，細(xì)胞最大密度1.23x106cell/ml，與對(duì)照組相比高1.24倍，最終細(xì)胞收獲數(shù)為8.53x108cells，相比對(duì)照組，提高了1.18倍。
　　6.流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞的膜表面蛋白修飾效率均達(dá)95％以上，說明此微載體培養(yǎng)PC-3細(xì)胞的平臺(tái)可以用于前列腺癌疫苗的

10、大規(guī)模制備。
　　結(jié)論：
　　本課題是利用微載體培養(yǎng)技術(shù)，建立了一種適合PC-3細(xì)胞在wave20/50生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)平臺(tái)，并經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)對(duì)PC-3細(xì)胞三維培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，創(chuàng)建了雙相血清濃度和間隔擺動(dòng)的培養(yǎng)方式，在2L細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)PC-3的最終細(xì)胞數(shù)約達(dá)109cells的產(chǎn)量，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高密度腫瘤疫苗的需求和后期臨床實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本課題的成功實(shí)施將使細(xì)胞膜表面修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗的研制水平更進(jìn)一