RNAi抑制前列腺癌細胞PC-3中survivin基因表達的實驗研究.pdf

1、本研究首先運用免疫細胞化學，免疫印跡技術及RT-PCR技術詳盡的檢測了5個前列腺癌細胞系中survivin在蛋白水平及mRNA水平上的表達，結果顯示，各前列腺癌細胞系survivin陽性細胞百分率，PC-3為23.4％，DU145為18.7％，LNCaP為15.2％，22RV1、PC-3M分別為11.5％和12.8％。免疫細胞化學染色陽性分值，PC-3為49.42±4.71，PC-3M為28.45±6.82，DU145為34.27±6.

2、08，LNCaP為34.09±5.22，22RV1為31.66±7.13。以PC-3細胞系中survivin的表達量最高(P＜0.01)。Westernblot結果顯示，PC-3、LNCaP、DU145細胞系中的survivin蛋白總量相對較高，而22RV1、PC-3M中的survivin蛋白總量相對較低，RT-PCR結果顯示，五種前列腺癌細胞系中均有survivin的表達，但以PC-3、LNCaP中的survivinmRNA水平較高。

3、研究結果表明，在研究survivin與前列腺癌的發(fā)生機制、抗藥性機制及作為新前列腺癌藥物靶位的可行性研究工作中，前列腺癌細胞系PC-3、LNCAP和DU145細胞可為首選。 隨后采用siRNA表達載體pSilencerTM3.1-H1neo構建針了對survivin基因的siRNA表達載體，首先根據(jù)siRNA設計原則及survivin的cDNA序列選取并設計survivin基因特異性插入序列共3對6條，將合成的DNA正義鏈及反義

4、鏈經(jīng)變性、退火，形成雙鏈DNA后再用T4DNA連接酶與pSilencerTM3.1-H1neo線性質粒連接，重組質粒經(jīng)酶切及DNA測序鑒定后，用脂質體法轉染非雄激素依賴前列腺癌細胞系PC-3，通過RNA干涉阻斷PC-3細胞中survivin基因的表達，用RT-PCR，免疫印跡技術和免疫細胞化學染色檢測survivin的表達變化，并用流式細胞技術、MTT法檢測survivin基因表達沉默后對PC-3細胞的抗凋亡能力，分化增殖能力，對化療藥

5、物的敏感性等方面的變化。DNA序列測定結果證實設計合成的DNA正確插入了載體。RT-PCR、免疫印跡和免疫細胞化學染色實驗表明，除pSilencer3.1-SVV1重組載體不能有效地阻斷了PC-3細胞中survivin基因的表達以外，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3重組載體均有效地阻斷了PC-3細胞中survivin基因的表達。與對照組相比，survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表達明顯下調(

6、P＜0.01)，并且轉染PC-3細胞后，細胞的凋亡增加了10-15％，細胞生長速度明顯變慢，其細胞數(shù)在84h時與對照組相比減少約30％，G1期細胞增加了10％，G2期和S期細胞減少了5％以上。在順鉑的作用下，pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3重組質粒轉染的PC-3細胞的細胞凋亡增加了10％至14％，存活數(shù)則下降了約35％至45％。 為了進一步觀察RNAi介導的survivin基因沉默對PC-3

7、前列腺癌細胞在裸鼠體內的瘤體形成能力的影響，應用構建的pSilencer3.1-SVV1、pSilencer3.1-SVV2、pSilencer3.1-SVV3質粒和陰性對照質粒pSilencer3.1-NC轉染PC-3細胞后，將PC-3細胞接種于荷瘤裸鼠皮下，觀察轉染了各質粒的PC-3細胞在裸鼠體內成瘤能力的變化。結果顯示，pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3質粒轉染組的裸鼠腫瘤成瘤率明顯下降，裸鼠瘤

8、體生長速度明顯慢于未轉染組和pSilencer3.1-NC質粒轉染組(P＜0.01)。實驗終止時，腫瘤平均體積與瘤重與未轉染組和pSilencer3.1-NC質粒轉染組相比減少50％～55％。研究結果表明，RNAi介導的survivin基因沉默可明顯影響PC-3細胞裸鼠體內成瘤能力及瘤體生長速度。 本研究初步闡明了survivin基因沉默對前列腺癌細胞的分化增殖，抗凋亡，體內瘤體形成及對化療藥物的敏感性等方面所產生一系列影響，證