辛伐他汀對人前列腺癌細胞PC-3的體外作用及其機制研究.pdf

1、目的：探討辛伐他汀(Simvastatin)對人前列腺癌細胞PC-3的體外作用及其相關機制，同時觀察辛伐他汀聯(lián)合抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel)、順鉑(Cisplatin)對PC-3細胞的體外作用。 方法：1將人前列腺癌細胞PC-3進行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-basedcolorimetricassay,MTT)比色法檢測辛伐他汀對該細胞增殖的影響，測定吸光度(OD)值。流式細胞儀測定辛伐他汀對

2、PC-3細胞周期分布和凋亡的影響，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變，通過DNA凝膠電泳進行DNA片斷化分析，流式細胞儀間接免疫熒光技術分析辛伐他汀作用后PC-3細胞p21Ras、E2F-1、CDK4、Bax蛋白表達的變化。2采用MTT比色法檢測辛伐他汀與抗癌藥物紫杉醇、順鉑聯(lián)合應用后對人前列腺癌細胞PC-3的增殖抑制作用，測定其吸光度(OD)值，并采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(IteractionIndex)，評價

3、聯(lián)合后的作用。如相互作用指數＞1為兩藥拮抗作用；相互作用指數=1為兩藥相加作用；相互作用指數＜1為兩藥協(xié)同作用。 結果：1MTT比色法顯示辛伐他汀(1、5、10、15、20、25、50μmol/L)對PC-3細胞具有抑制增殖的作用。不同濃度辛伐他汀處理細胞24～96h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，差異具有顯著性(P＜0.05)。且隨辛伐他汀處理濃度的增大、作用時間的延長，OD值逐漸下降，即辛伐他汀對PC-3細

4、胞的增殖抑制作用有明顯的劑量—效應和時間—效應依賴關系。辛伐他汀處理細胞48、72、96h，IC50分別為17.13μmol/L、5.56μmol/L、3.24μmol/L。辛伐他汀作用PC-3細胞后，有明顯的細胞形態(tài)學改變：PC-3細胞縮小呈紡錘狀，兩端各有一細長的偽足。隨辛伐他汀濃度增大和作用時間延長，這種變化逐漸明顯，PC-3細胞漸變圓，貼壁細胞減少，脫落細胞增多。同時可見到細胞凋亡的形態(tài)學改變：細胞皺縮、破裂呈不規(guī)則形，在細胞周

5、圍有放射狀分布的點片狀細胞碎片，有的細胞胞漿中出現(xiàn)空泡。隨藥物濃度增加和作用時間延長，細胞破碎增多，培養(yǎng)液中可見到大量細胞碎片。DNA凝膠電泳顯示5、10、20μmol/L辛伐他汀處理PC-3細胞48h后，出現(xiàn)典型的階梯狀排列的DNA梯帶，而對照組則無。流式細胞儀檢測PC-3細胞周期分布和凋亡顯示，0、5、10、20μmol/L辛伐他汀作用PC-3細胞48h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細胞逐漸增多；S期和G2/M期細胞則逐漸減少。即

6、辛伐他汀可阻滯PC-3細胞周期進程于G1期，該作用呈劑量—效應依賴關系。0、5、10、20μmol/L辛伐他汀處理細胞48h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依辛伐他汀濃度增大而逐漸升高；凋亡百分率分別為：1.06％、6.24％、12.46％、17.21％。流式細胞儀間接分析細胞p21Ras、E2F-1、CDK4、Bax的蛋白表達顯示，0、5、10、20μmol/L辛伐他汀處理PC-3細胞48h后，p21Ras、E2F-1、CDK4的熒光指

7、數FI值隨處理濃度增大而逐漸減??；Bax的FI值則隨處理濃度增大而逐漸增大。對于每一種蛋白，比較其處理組和對照組的FI值，差異具有顯著性(P＜0.05)。2MTT比色法分析辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇、順鉑對PC-3細胞的增殖抑制作用，結果顯示：≥2μmol/L的辛伐他汀可加強紫杉醇對PC-3細胞的增殖抑制作用。在2～10μmol/L范圍內，隨辛伐他汀濃度的增大，其對紫杉醇的協(xié)同作用增強。單用紫杉醇的IC50為10-6.13mol/L，聯(lián)合2μm

8、ol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-6.40mol/L；聯(lián)合5μmol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-6.61mol/L；聯(lián)合10μmol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-7.40mol/L。因此，在一定濃度范圍內，辛伐他汀可協(xié)同紫杉醇抑制PC-3細胞的生長增殖。在2～10μmol/L范圍內，辛伐他汀可協(xié)同順鉑抑制PC-3細胞生長增殖，且隨藥物濃度增大，這種協(xié)同作用增強。單用順鉑的IC50為1.4

9、4μg/ml，聯(lián)合2μmol/L辛伐他汀后可將順鉑的IC50降低至1.15μg/ml；聯(lián)合5μmol/L辛伐他汀后可將順泊的IC50降低至0.92μg/ml；聯(lián)合10μmol/L辛伐他汀后可將順鉑的IC50降低至0.52μg/ml。因此，辛伐他汀可加強順鉑對PC-3細胞的增殖抑制作用。3Isobolanalysis分析相互作用指數顯示，辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇、順鉑在細胞生長抑制率為50％時的相互作用指數均小于1，證明辛伐他汀確實可協(xié)同紫杉醇

10、、順鉑對PC-3細胞的增殖抑制作用；辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇的相互作用指數小于辛伐他汀聯(lián)合順鉑的相互作用指數，說明辛伐他汀對紫杉醇的協(xié)同作用大于其對順鉑的協(xié)同作用。 結論：1本研究首次通過體外實驗證實了HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀具有抗激素非依賴性前列腺癌細胞PC-3的作用，為激素非依賴性前列腺癌的治療提供了新的理論依據。2本實驗證實辛伐他汀具有抑制前列腺癌細胞PC-3增殖的作用，且此作用呈時間—劑量依賴關系。3本實驗證實辛伐他

11、汀可阻滯前列腺癌細胞PC-3于G1期并可誘導該細胞凋亡。4我們初步推論辛伐他汀通過下調p21Ras、E2F-1、CDK4蛋白的表達和上調Bax蛋白的表達而發(fā)揮其抑制前列腺癌細胞PC-3增殖、誘導該細胞凋亡的作用。5本實驗證實辛伐他汀可協(xié)同紫杉醇、順鉑對PC-3細胞的增殖抑制作用；辛伐他汀對紫杉醇的協(xié)同抗瘤作用大于其對順鉑的協(xié)同抗瘤作用。6本實驗證實了辛伐他汀這一臨床常用的降脂藥物具有抗前列腺癌的作用，并通過辛伐他汀聯(lián)合兩種化療藥物的研究