脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對(duì)血管基質(zhì)成分造血功能的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　血管基質(zhì)成分(SVF)是從脂肪組組中分離出來的細(xì)胞群，目前已廣泛應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域。SVF中含有造血干/祖細(xì)胞，但數(shù)量少并且歸巢能力低。在目前造血干細(xì)胞供者來源困難的情況下，如何對(duì)SVF中的造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行有效擴(kuò)增，提高其歸巢能力，是亟需解決的重要問題。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stromal cells，ADSCs)是一種多能干細(xì)胞，可促進(jìn)移植后的造血重建。然而ADSCs的安全性限制了其在臨

2、床的廣泛應(yīng)用。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(exosomes)是ADSCs釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性囊泡。exosomes介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制在ADSCs為基礎(chǔ)的治療中發(fā)揮作用。因此本課題擬探討ADSC-exsomes對(duì)SVF中造血細(xì)胞增殖和歸巢的作用，為SVF的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為造血功能損傷修復(fù)治療提供新的思路。
　　方法:
　　1.Ⅰ型膠原酶搖床消化人脂肪組織，分離獲取SVF，免疫磁珠分選SVF-CD34+細(xì)胞。通過流

3、式細(xì)胞表型分析、造血干細(xì)胞集落培養(yǎng)、脾集落證實(shí)SVF-CD34+細(xì)胞的造血功能。
　　2.貼壁培養(yǎng)法分離純化ADSCs，鑒定其表型和功能型鑒定。運(yùn)用超濾法和密度梯度離心法從第3代ADSCs中分離ADSCs-exosomes。通過透射電鏡形態(tài)學(xué)、納米顆?？梢曅苑治鱿到y(tǒng)、Western Blot檢測(cè)exosomes表面標(biāo)志性蛋白對(duì)ADSC-exosomes進(jìn)行鑒定。
　　3.ADSC-exosomes與SVF-CD34+細(xì)胞共培

4、養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞比例、細(xì)胞周期及造血干細(xì)胞集落，探討ADSCs-exosomes對(duì)細(xì)胞增殖的影響。SVF-CD34+細(xì)胞用CM-DIL標(biāo)記，與ADSC-exosomes共同植入TBI的NOD/SCID小鼠，熒光顯微鏡下觀察SVF-CD34+細(xì)胞在骨髓腔和外周器官的定位，流式細(xì)胞檢測(cè)骨髓腔內(nèi)熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)，熒光定量PCR檢測(cè)移植前后骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CXCR4mRNA表達(dá)水平，探討ADSCs-exosomes對(duì)SV

5、F-CD34+細(xì)胞歸巢的作用。
　　4.ADSC-exosomes與SVF-CD34+共同植入，通過生存分析、血常規(guī)監(jiān)測(cè)、骨髓常規(guī)、GVHD評(píng)估、流式細(xì)胞hCD45比例等指標(biāo)探討ADSC-exosomes是否有助于SVF-CD34+細(xì)胞的造血重建。
　　結(jié)果:
　　1.人脂肪組織中分離的SVF-CD34+細(xì)胞具有造血干/祖細(xì)胞的免疫表型和功能型。
　　2.超濾法結(jié)合密度梯度離心法成功分離ADSC-exosomes

6、。透射電子顯微鏡顯示ADSC-exosmes是一群圓形或橢圓形膜性小囊泡，有完整胞膜，直徑分布在76nm左右，exosomes相關(guān)蛋白CD63、CD9、CD81呈陽性表達(dá)，這些結(jié)果均符合exosomes的特性。
　　3.ADSC-exosomes與SVF-CD34+共培養(yǎng)后，ADSC-exosomes對(duì)SVF-CD34+細(xì)胞的增殖呈濃度依賴性，隨濃度增加增殖作用增強(qiáng)。共培養(yǎng)7天仍有足夠的細(xì)胞處于分裂前期，有助于維持其干細(xì)胞特性。A

7、DSC-exosomes能增加SVF-CD34+細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADSC-exosomes共移植可以使更多的SVF-CD34+細(xì)胞有效歸巢至骨髓腔。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示SDF-1、CXCR4基因轉(zhuǎn)錄水平較移植前升高。
　　4.ADSC-exosomes與SVF-CD34+細(xì)胞共移植的NOD/SCID小鼠，血常規(guī)恢復(fù)時(shí)間較單獨(dú)移植SVF-CD34+細(xì)胞組縮短，骨髓和脾臟中有更高比例的人源細(xì)胞植入。

8、>　　結(jié)論:
　　1.本研究成功建立了從人脂肪組織中分離獲取SVF-CD34+細(xì)胞的方法，并證實(shí)SVF-CD34+細(xì)胞的造血潛能。
　　2.利用超濾法結(jié)合蔗糖密度梯度離心法可以從ADSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清中可以獲得高純度的外泌體樣本。
　　3.ADSC-exosomes支持SVF-CD34+細(xì)胞的體外增殖，提高SVF-CD34+細(xì)胞的CXCR4mRNA表達(dá)水平。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADSC-exosomes有助于