間充質干細胞外泌體對急性肺損傷小鼠的影響及相關機制的實驗研究.pdf

1、背景與目的:
　　急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見的危重病癥，其起病急驟，病情兇險，死亡率高。ARDS的常見病因為感染，重癥感染極易導致膿毒癥的發(fā)生，而膿毒癥是多器官衰竭包括ARDS的前奏。盡管國內外學者針對膿毒癥致ARDS的治療進行了大量的研究，但總的看來，結果不能令人滿意，其病死率仍高達40％以上。
　　間充質干細胞（mesenchymal

2、stem cells，MSCs）具有多向分化能力，取材簡便，提取過程較簡單，不會發(fā)生免疫排斥反應具有重要的免疫調節(jié)和抗炎活性，是理想的組織修復來源，一系列臨床前研究證實其能顯著改善ARDS的癥狀及預后。但是直接移植具有致瘤、栓塞、異常分化、免疫調節(jié)不可控等風險，對其應用造成限制。
　　間充質干細胞外泌體(exosomes)是MSCs在靜息或活化狀態(tài)下釋放到細胞外基質中的膜分泌體系，不僅含有間充質干細胞的活性物質，而且具有選擇性組裝

3、、靶向性投遞、高效修復受損組織、安全性高，化學性質穩(wěn)定易于保存等優(yōu)點，是干細胞領域具有重要研究價值的新興熱點。
　　本研究擬將間充質干細胞外泌體用于急性肺損傷小鼠模型的干預治療，從生存率、損傷程度、通透性改變、炎癥反應和氧化應激反應等五方面評價間充質干細胞外泌體的生物學效應并探討其相關的機制，為ALI的治療探索新方法。
　　方法與結果:
　　首先分離出MSCs，分離過程采用組織細胞貼壁法，分離后培養(yǎng)和擴增至第三代，然后

4、通過流式細胞儀檢測表明標志物，分化誘導培養(yǎng)對MSCs進行成脂、成骨和成軟骨鑒定，最后采用超高速離心法得到MSCs上清中的外泌體，并對外泌體進行表面標志物的鑒定。采用盲腸結扎穿孔法（Cecal ligation perforation，CLP）建立ALI小鼠模型，然后將200只小鼠隨機地分為正常對照組即生理鹽水組(Saline組)、CLP加尾靜脈注入等量生理鹽水對照組（CLP+Saline組）、CLP加尾靜脈注入去除外泌體MSC濃縮上清對

5、照組（CLP+ExD-CM組）和CLP加尾靜脈注入外泌體實驗組（CLP+Exsomes組）。結果顯示:在6h和24h時間點，CLP+Exsomes實驗組肺組織病理切片的病變程度明顯減輕，病理評分有統(tǒng)計學意義;CLP+Exsomes實驗組肺濕干比和肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白含量與對照組CLP+Saline和CLP+ExD-CM比較明顯減低;CLP+Exsomes實驗組BALF中中性粒細胞數(shù)量和肺組織髓過氧化物酶(MPO)的活性與對照組

6、比較明顯降低;CLP+Exsomes實驗組BALF中和血漿中促炎因子水平與對照組相比明顯降低而抗炎因子水平明顯增高;另外隨機將40只小鼠分為同樣的4組單獨測試生存率，最終結果提示與對照組相比，CLP+Exsomes組7天生存率明顯增高;CLP+Exsomes實驗組肺組織抗氧化應激酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)比對照組明顯增高;免疫組化示CLP+Exsomes實驗組肺組織誘導型一氧化

7、氮合酶iNOS陽性的細胞較對照組減少，且肺組織反應脂質過氧化活性的丙二醛(MDA)濃度明顯降低;肺組織免疫蛋白印記顯示CLP+Exsomes實驗組肺組織MAPK、NF-kB表達明顯降低，而血紅素加氧酶-1(HO-1)、Nrf-2明顯增高。
　　結論:
　　1.運用組織細胞貼壁法能成功從人臍帶中分離MSCs，并可在體外培養(yǎng)擴增。
　　2.運用超高速離心法能成功從人臍帶MSCs上清中提取外泌體，其表達CD9、CD63、 C