研究不同培養(yǎng)模式對間充質干細胞促進造血干細胞增殖的影響及機制.pdf

1、目的：通過研究間充質干細胞(MSC)在不同共培養(yǎng)模式下對造血干細胞(HSC)體外增殖的影響，并探究其機制，從而盡可能真實地模擬體內HSC增殖的骨髓微環(huán)境，尋找更好的促進HSC體外增殖的方法。
　　方法：1.C57小鼠MSC分離、培養(yǎng)：采用全骨髓培養(yǎng)法，將C57BL/6小鼠骨髓細胞，在胎牛血清含量為10％、青-鏈霉素含量為1％、DMEM-F12含量為89％的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第一個48h行半量換液，此后每隔2天行全量換液一次，于倒置相差

2、顯微鏡下動態(tài)對細胞的形態(tài)變化及生長情況進行觀察。至培養(yǎng)瓶底面的細胞長至約90％融合時，按1∶2比例傳代。連續(xù)觀察P0、P1、P2、P3代MSC生長情況、形態(tài)變化。2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定：通過密度梯度離心，獲得稀釋液層下的小鼠骨髓單個核細胞(MNC)，MACS-CD117+磁珠分選HSC。應用流式細胞計數(shù)儀(FACS)檢測CD117陽性細胞的純度。3.間充質干細胞促進造血干細胞增殖的研究：設置對照組：HSC組（24孔板內單獨接種

3、造血干細胞）、MSC組（24孔板內單獨接種間充質干細胞）;實驗組：Transwell共培養(yǎng)組（24孔板對應規(guī)格Transwell內單獨接種造血干細于上室、間充質干細胞于下室）、2D接觸共培養(yǎng)組（24孔板共同接種造血干細胞與間充質干細胞）。體外培養(yǎng)7天，觀察HSC生長情況、形態(tài)變化、進行細胞計數(shù)、并繪制生長曲線、Cell Counting Kit（CCK-8）法測定HSC擴增情況。測定各個組MSC細胞數(shù)量，ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中SD

4、F-1及VFGF的表達情況。
　　結果：1.C57BL/6小鼠的MSC的分離培養(yǎng)：倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)5天開始出現(xiàn)梭形貼壁細胞，約第12天梭形細胞融合度可達90％-95％。傳代后細胞貼壁生長較快，多在24h內貼壁。傳至第3代后6-7天可生長達80％融合并呈長梭形密集排列。間充質干細胞經傳代后的細胞純度逐漸升高。2.GFP小鼠的HSC的分離鑒定：實驗中平均每只GFP小鼠的骨髓細胞液經密度梯度離心后可以獲得約5.5×107個單個核

5、細胞，經臺盼藍染色計數(shù)活性細胞率為97％。MNC經MACS CD117磁珠分選后，平均可以獲得約1.3×105個CD117+細胞，活細胞率為98％。骨髓MNC中CD117+細胞含量約0.24％。熒光顯微鏡下可見HSC呈圓形，并可激發(fā)出綠色熒光，大小均一。流式鑒定結果顯示，磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51％。3.不同培養(yǎng)模式下間充質干細胞對造血干細胞增殖的影響：①鏡下觀察MSC對HSC增殖的影響：熒光顯微鏡觀察顯示：各組HS

6、C細胞數(shù)量隨著共培養(yǎng)時間的延長而增多，且2D共培養(yǎng)組熒光細胞數(shù)量較其他組明顯增多;②計數(shù)法檢測MSC對HSC增殖的影響：對細胞計數(shù)進行分析：共培養(yǎng)第1天，3組HSC活性細胞數(shù)量與接種時(d0)比較，HSC組（control group，單獨培養(yǎng)HSC組）與接種時比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.151）;Transwell共培養(yǎng)組與接種時比較，P=0.010;2D共培養(yǎng)組與接種時比較，P=0.002。共培養(yǎng)第1天比較3組中HSC數(shù)量，H

7、SC單獨培養(yǎng)組與Transwell組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.718);2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于Transwell組，P=0.0000。共培養(yǎng)第3天，3組間HSC細胞數(shù)量比較，Transwe11共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.004;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.002;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.010。共培養(yǎng)第5天，3組間HSC細胞數(shù)量比較，Transw

8、ell共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.039;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.000。共培養(yǎng)第7天，3組間HSC細胞數(shù)量比較，Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.000。③CCK-8法檢測HSC增殖：對1、3、5、7天HSC樣本進行C

9、CK-8檢測OD值，從生長曲線可以看出，隨培養(yǎng)時間的延長各組HSC數(shù)量均隨之增加，第3天開始HSC細胞進入對數(shù)生長期，與MSC共培養(yǎng)對HSC增殖有促進作用，2D共培養(yǎng)模式較Transwell共培養(yǎng)的促進作用更明顯。共培養(yǎng)第一天，HSC單獨培養(yǎng)組與Transwell共培養(yǎng)組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.151）;HSC單獨培養(yǎng)組與2D共培養(yǎng)組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.054）。共培養(yǎng)3-7天，共培養(yǎng)組細胞增殖明顯高于HSC單獨

10、培養(yǎng)組，P＜0.05;且2D共培養(yǎng)組明顯高于Transwell共培養(yǎng)組，P＜0.05。4.不同培養(yǎng)模式下，間充質干細胞促進造血干細胞增殖可能的機制：①培養(yǎng)第7天，采用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)液中SDF-1含量，結果顯示：2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;Transwell組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于MSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;Transwell組高于MSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于

11、Transwell組，P=0.017。②培養(yǎng)第7天，采用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)液中VEGF含量，結果顯示：2D組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.0000,Transwell組高于HSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于MSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000,Transwell組高于MSC單獨培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于Transwell組，P=0.009。③計數(shù)法檢測共培1、3、5、7天各組MSC數(shù)量，結果顯示：MSC細胞數(shù)量

12、隨培養(yǎng)時間的延長而增加，自第3天進入對數(shù)生長期，2D和Transwell共培養(yǎng)組的MSC數(shù)量均高于MSC單獨培養(yǎng)組，2D共培養(yǎng)組細胞數(shù)量高于Transwell共培養(yǎng)組，以第7天最為明顯。④對第7天HSC細胞數(shù)量、MSC細胞數(shù)量、SDF-1含量、VEGF含量進行相關性分析，結果顯示：SDF-1、VEGF與HSC、MSC細胞數(shù)量間呈明顯正相關(P＜0.05)。
　　結論：1.與間充質細胞進行共培養(yǎng)的造血干細胞的增殖能力強于單獨培養(yǎng)的造

13、血干細胞，且2D接觸共培養(yǎng)的模式對造血干細胞增殖的促進作用優(yōu)于非接觸共培養(yǎng)模式。2.2D接觸共培養(yǎng)模式促進造血干細胞增殖作用更強的機制可能有以下幾點：①MSC與HSC在2D接觸共培養(yǎng)模式下，分泌了更多的血管生成因子(VEGF)和趨化因子（SDF-1）。②SDF-1和VEGF的分泌具有相關性，共同促進了HSC和MSC的增殖。③HSC對MSC增殖的具有促進作用，MSC的增殖能力在接觸共培養(yǎng)模式下較非接觸共培養(yǎng)模式更強，增殖的MSC進一步促進