脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能活性，進(jìn)一步明確脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管生成的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而驗(yàn)證和了解脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的分子機(jī)制，探討AD-MSCs促進(jìn)HUVECs發(fā)揮功能活性的途徑，為進(jìn)一步研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞治療體系在臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定①分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪組織來(lái)自健康女性吸脂者，經(jīng)組織標(biāo)本所屬人知情。②用誘導(dǎo)液對(duì)分離

2、培養(yǎng)的脂肪來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞方向分化，分別用油紅O和茜素紅-S檢測(cè)其向成脂和成骨分化。③通過(guò)流式細(xì)胞儀明確人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。
　　第二部分選取第3-6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，由原來(lái)含10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，過(guò)夜收集其上清液，離心后加入3％和5％的FBS備用。用含相應(yīng)濃度FBS的DMEM設(shè)立正常對(duì)照組，分別進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕

3、實(shí)驗(yàn)、Matrigel成管實(shí)驗(yàn)、Matrigel三維培養(yǎng)的出芽實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)差表示，
　　第三部分分子機(jī)制研究①用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)收集上清液VEGF濃度;②在Transwell體系間接共培養(yǎng)，觀察HUVEC在AD-MSCs的誘導(dǎo)下遷移。③用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定Transwell培養(yǎng)體系中VEGF濃度水平;④分析培養(yǎng)體系中AD-MSCs與HUVECs分泌VEGF的差異性。⑤提取相應(yīng)HUV

4、ECs的總蛋白和總RNA。進(jìn)行Western blot檢測(cè)，測(cè)定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表達(dá);⑥以提取的RNA為模板，轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)一步進(jìn)行Real-time PCR，檢測(cè)HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分.①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和AD-MSCs在10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液流式鑒定培養(yǎng)下生長(zhǎng)良好。②培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞

5、免疫組織化學(xué)CD31陽(yáng)性，定位于細(xì)胞膜。③FCM結(jié)果顯示，CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占檢測(cè)總數(shù)的98.3％，CD34陽(yáng)性細(xì)胞僅占檢測(cè)總數(shù)的0.016％。④脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞即骨細(xì)胞，油紅O和茜素紅S檢測(cè)陽(yáng)性。
　　第二部分①CCK-8細(xì)胞增殖活力檢測(cè)用MSC-CM處理的HUVECs24小時(shí)與對(duì)照組P值＜0.01，兩者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)36小時(shí)后，P值＜0.05，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②劃痕實(shí)驗(yàn)MSC-CM組在前六小時(shí)

6、的遷移速率就高于Control組。至12小時(shí)，MSC-CM組細(xì)胞侵入面積已達(dá)42％，而對(duì)照組僅為10％左右。③管腔形成實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組節(jié)點(diǎn)數(shù)平均為21個(gè)/視野，而對(duì)照組為12個(gè)/視野，成組T檢驗(yàn)得知P＜0.001，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④出芽實(shí)驗(yàn)亦顯示，實(shí)驗(yàn)組與Control組P=0.004，兩者具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第三部分①脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清的VEGF濃度與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清中VEGF的濃度兩者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P＜0.01)。②Transwell遷移實(shí)驗(yàn)AD-MSCs誘導(dǎo)組與對(duì)照組兩者具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。③來(lái)自AD-MSCs組的上清液中VEGF濃度為26.87±2.77pg/mL，而Vehicle組則僅為7.65±1.23pg/mL(表3-6)，兩者有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。④每1×104個(gè)細(xì)胞為單位，HUCVEC-CM與MSC-CM之間比較分泌VRGF的量有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);⑤經(jīng)MS