瑞舒伐他汀預(yù)處理對局灶性缺血再灌注大鼠自噬水平的影響.pdf

1、目的：
　　腦卒中是目前全球長期致殘的主要原因之一，也是導(dǎo)致城鎮(zhèn)居民死亡的第三位因素。據(jù)統(tǒng)計，85％～90％的發(fā)病人群為缺血性卒中，缺血再灌注損傷是致殘和致死的主要原因。近年來研究表明，除了炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，過度激活的自噬也參與了IRI的病理進程。臨床研究結(jié)果也顯示抑制過度激活的自噬反應(yīng)可以緩解腦缺血再灌注損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護作用。他汀類藥物作為臨床推薦神經(jīng)保護劑取得了廣泛運用，研究者在心臟缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，該類藥物不僅具

2、有抗炎及抗氧化應(yīng)激的作用，還可以調(diào)節(jié)細胞自噬水平。瑞舒伐他汀是經(jīng)典他汀類藥物之一，屬于選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑，具有半衰期長、體內(nèi)血藥濃度高等優(yōu)點。研究表明，瑞舒伐他汀預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)具有保護作用，其機制可能與抑制神經(jīng)細胞凋亡和局部炎性反應(yīng)有關(guān)。然而，細胞自噬是否參與了腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制，以及該病理過程是否受到瑞舒伐他汀的調(diào)控，國內(nèi)研究尚為空白。本研究采用栓線法建立大腦中動脈栓塞(MCAO)局灶

3、性急性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察腦缺血再灌注損傷過程中缺血半暗帶神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞病理形態(tài)及自噬水平的變化;并選擇瑞舒伐他汀作為神經(jīng)保護劑，分析瑞舒伐他汀預(yù)處理是否也可以通過調(diào)節(jié)自噬水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為進一步完善其潛在的神經(jīng)保護機制提供數(shù)據(jù)支撐。
　　方法：
　　1、局灶性急性腦缺血再灌注大鼠模型的制備
　　選取健康成年雄性SD大鼠75只，隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、MCAO模型組、瑞舒伐他汀預(yù)處理組和溶劑組5

4、組，各組15只?？瞻讓φ战M正常飼養(yǎng);MCAO模型組、瑞舒伐他汀預(yù)處理組和溶劑組采用栓線法建立MCAO局灶性急性腦缺血再灌注大鼠模型，栓塞時長90 min;假手術(shù)組僅給予頸部皮膚切開和頸總動脈游離系線處理，不進行栓塞。除此之外，瑞舒伐他汀預(yù)處理組和溶劑組分別于模型制備前（缺血前）30min腹腔注射瑞舒伐他汀和二甲基亞砜(DMSO)。90min后拔出線栓，即完成缺血后再灌注模型制備。采用改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分(mNSS)標準對各組大鼠進行

5、神經(jīng)行為學(xué)評分，評價模型制備成功率。
　　2、缺血半暗帶神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察
　　缺血再灌注（拔出線栓）90min后，采用TTC染色法測定腦梗死面積，電鏡下觀察缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)和自噬泡數(shù)量。
　　3、細胞自噬激活定位和水平測定
　　采用免疫熒光雙標實驗，觀察LC-3B與NeuN、LC-3B與GFAP、LC-3B與Iba-1的雙標圖像，確定自噬激活位置是在神經(jīng)元內(nèi)還是膠質(zhì)細胞內(nèi)。采用免疫

6、蛋白印跡（Western Blot）實驗檢測腦缺血半暗帶區(qū)域自噬體膜蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A、3B（LC-3A，LC-3B）及前自噬體膜蛋白Beclin1的表達量。
　　4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組之間的比較行單因素方差分析，期間任意兩組之間的比較行LSD-t檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比或百分比表示，行卡方檢驗;等級資料行秩和檢驗;P＜0.05表明差異有

7、統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、模型評價
　　空白對照組和假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能損害癥狀，mNSS評分均為0;MCAO模型組、瑞舒伐他汀預(yù)處理組和溶劑組均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損害癥狀，mNSS平均分分別為（11.2±1.26）分、（10.9±1.12）分、（11.4±1.31）分，其組間的mNSS評分有統(tǒng)計學(xué)差異，瑞舒伐他汀預(yù)處理組明顯低于其他兩組（P＜0.05）。
　　2、缺血半暗帶神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)

8、r>　　TTC染色后，腦梗死區(qū)域呈現(xiàn)蒼白色，非腦梗死區(qū)域呈現(xiàn)紅色，蒼白色區(qū)域與大腦中動脈供血區(qū)域一致。就梗死面積而言，瑞舒伐他汀預(yù)處理組較MCAO模型組和溶劑組小，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;MCAO模型組和溶劑組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。此外，瑞舒伐他汀預(yù)處理組凋亡細胞和自噬泡數(shù)量較MCAO模型組和溶劑組少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;MCAO模型組和溶劑組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、細胞

9、自噬激活定位和水平
　　免疫熒光共聚焦顯微鏡下，LC-3B為綠色熒光，NeuN為紅色熒光，缺血半暗帶區(qū)域呈現(xiàn)綠色熒光和紅色熒光重疊色-橙色，說明LC-3B主要定位于神經(jīng)元細胞。Western blot實驗結(jié)果顯示，MCAO模型組、瑞舒伐他汀預(yù)處理組和溶劑組的LC-3A，LC-3B及Beclin1蛋白表達水平明顯高于空白對照組和假手術(shù)組(P＜0.05)，空白對照組和假手術(shù)組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);瑞舒伐他汀預(yù)處理組的LC-

10、3A，LC-3B及Beclin1蛋白表達水平明顯低于MCAO模型組和溶劑組(P＜0.05)，MCAO模型組和溶劑組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、缺血缺氧性損傷能夠促進缺血半暗區(qū)自噬泡和自噬溶酶體的形成，啟動自噬反應(yīng)，且存在細胞自噬和細胞凋亡共存的特點。
　　2、自噬因子LC主要表達于神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞也有少量分布，合理調(diào)控三種神經(jīng)細胞的自噬轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，均有可能起到神經(jīng)保護作用。