嗜酸乳桿菌對重型顱腦損傷小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路影響的研究.pdf

1、腸動力不足(Intestinal motility deficiency，IMD)是重型顱腦損傷(Severe head injury,SHI)后常見的并發(fā)癥。如果不能在早期進(jìn)行有效的防治，可引起腸道菌群紊亂、加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，甚至誘發(fā)多器官功能障礙綜合征。目前臨床用于防治IMD的藥物均存在一定的副作用。近年來，益生菌在危重癥患者治療中的作用受到關(guān)注。研究表明，益生菌不僅能糾正嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的腸道菌群失調(diào)，還具有改善腸動力的作用。但迄今大

2、多數(shù)研究僅觀察了用益生菌后的效果，對其改善腸動力相關(guān)機(jī)制的研究較少。平滑肌細(xì)胞的收縮舒張是腸動力的最終效應(yīng)器，而鈣依賴性通路是調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮的重要通路。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時胞外Ca2+可經(jīng)細(xì)胞膜上的Cav1.2鈣離子通道流入細(xì)胞內(nèi)，同時胞內(nèi)鈣庫也會通過肌質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3R、RyR3釋放部分Ca2+，使胞內(nèi)游離的Ca2+濃度升高，Ca2+與CaM、MLCK形成Ca2+/CaM/MLCK復(fù)合物，最終使MLC20磷酸化，引起平滑肌收縮。由

3、此可見，MLC20的磷酸化水平與平滑肌細(xì)胞的收縮有密切的關(guān)系。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PKC在調(diào)節(jié)MLC20磷酸化水平及腸道平滑肌收縮中也至關(guān)重要。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可改善SHI小鼠腸道平滑肌的收縮功能，本研究在此基礎(chǔ)上采用SHI小鼠腸動力不足模型，以調(diào)節(jié)腸道平滑肌收縮的鈣依賴性通路為切入點(diǎn)，分別在給SHI小鼠灌胃嗜酸乳桿菌1d、3d、7d后觀察其腸道平滑肌鈣依賴性通路中信號分子的變化，初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動力不足的可能

4、機(jī)制。本課題旨在為嗜酸乳桿菌用于創(chuàng)傷領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時對探討益生菌改善腸動力的相關(guān)機(jī)制提供參考依據(jù)。
　　目的:觀察SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號分子的表達(dá)變化，明確嗜酸乳桿菌對傷后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路的影響，初步揭示嗜酸乳桿菌改善SHI小鼠腸動力不足的分子機(jī)制。
　　方法:本研究將90只健康雄性C57BL/6小鼠(18-24g)隨機(jī)分為假傷組、損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組（每組30只）。每組小鼠均分為1d、

5、3d、7d三個時相點(diǎn)（每一時相點(diǎn)10只小鼠）。各組小鼠均用5％的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。損傷組和損傷+嗜酸乳桿菌組均采用改良的Feeney's自由落體撞擊法建立SHI后腸動力不足小鼠模型。假傷組只開骨窗，不進(jìn)行打擊。傷后約4h待小鼠清醒后開始灌胃。假傷組及損傷組小鼠灌胃0.5ml嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基溶液，損傷+嗜酸乳桿菌組灌胃相同體積的嗜酸乳桿菌混懸液（約含菌1×1010CFU）。每天灌胃一次，其余時間均自由飲食水。分別在傷后1d、3d、7d

6、留取末端回腸（距盲腸1.5cm）。蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測20KDa肌球蛋白輕鏈(MLC20)的磷酸化水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)量，ELISA檢測MLCK的活性。ELISA檢測PKC蛋白水平、L型鈣離子通道Cav1.2、三磷酸肌醇受體(IP3R)、雷諾定受體(RyR3)的表達(dá)量。
　　結(jié)果:1.MLC20磷酸化水平變化
　　W

7、estern blotting結(jié)果:與假傷組相比較，MLC20在SHI后1d、3d、7d的磷酸化水平均明顯降低（損傷組 vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.05）;嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌MLC20的磷酸化水平顯著升高(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d: P＜0.05)。
　　2.MLCK表達(dá)量及活性變化
　　ELISA及免疫組化結(jié)果:MLCK在SHI后1d、3d、7d的蛋白濃度均

8、明顯低于假傷組（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.05）;嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后MLCK的濃度均顯著高于損傷組（損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d:P＜0.01）。同時，傷后1d、3d、7d的MLCK活性均低于相同時相點(diǎn)假傷組MLCK的活性（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d:P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d和7d后MLCK的活性顯著增強(qiáng)，且與損傷組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷

9、組，1d，3d，7d:P＜0.05)。
　　3.PKC蛋白水平變化
　　ELISA結(jié)果:SHI后1d、3d、7d的PKC水平明顯高于假傷組相同時間點(diǎn)PKC的水平(損傷組vs假傷組，1d，3d，7d: P＜0.05);嗜酸乳桿菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠腸道平滑肌PKC水平顯著降低(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d:P＜0.05)。
　　4.Cav1.2表達(dá)量變化
　　ELISA結(jié)果:SHI后第

10、1d及損傷3d和7d后，小鼠腸道平滑肌Cav1.2的表達(dá)量均明顯降低（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d，P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d和7d后Cav1.2的表達(dá)量均顯著高于損傷組(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d，7d: P＜0.01)。
　　5.IP3R表達(dá)量變化
　　ELISA結(jié)果:IP3R在SHI后第1d及傷后3d和7d的表達(dá)量均明顯低于相同時相點(diǎn)假傷組IP3R的表達(dá)量（損傷組vs假傷組，1d，3d

11、，7d，P＜0.01）;IP3R在嗜酸乳桿菌灌胃1d后的表達(dá)量雖有升高，但與損傷組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d:P＞0.05)，嗜酸乳桿菌灌胃3d和7d后SHI小鼠腸道平滑肌IP3R表達(dá)量顯著提高（損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，3d，7d: P＜0.01）。
　　6.RyR3表達(dá)量變化
　　ELISA結(jié)果:SHI后1d、3d、7d的RyR3表達(dá)水平均顯著降低（損傷組vs假傷組，1d，3d，7d，P

12、＜0.01）;嗜酸乳桿菌灌胃第1d及灌胃3d和7d后RyR3蛋白水平均有升高，但與損傷組相比差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(損傷+嗜酸乳桿菌組vs損傷組，1d，3d,7d: P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路信號分子的表達(dá)水平發(fā)生異常變化。
　　2.SHI后小鼠腸道平滑肌鈣依賴性通路中MLC20的磷酸化水平降低，MLCK的活性減弱、表達(dá)量下降。嗜酸乳桿菌可增強(qiáng)傷后MLCK的活性、提高M(jìn)LCK的表達(dá)量及M