尼古丁對人Vγ9Vδ2-T細胞抗腫瘤活性的影響.pdf

1、目的：研究尼古丁對人Vγ9Vδ2-T細胞殺傷腫瘤細胞活性的影響，并進一步研究其作用途徑及分子機制。
　　方法：通過密度梯度離心法獲取健康志愿者外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）；應(yīng)用帕米磷酸鹽（Pamidronate,PAM）聯(lián)合人重組白介素2（Interleukin-2,IL-2）體外擴增Vγ9Vδ2-T細胞，并用流式細胞術(shù)檢測其擴增前后免疫表型及細胞因子的表達量；

2、使用流式細胞術(shù)檢測經(jīng)磁珠純化后Vγ9Vδ2-T細胞的純度；利用Western blot及免疫熒光法檢測尼古丁受體α7-nAchR在 Vγ9Vδ2-T細胞中的表達；Vγ9Vδ2-T細胞經(jīng)梯度濃度尼古丁處理后，利用AnnexineV-PI法檢測其凋亡水平；選取無吸煙史的健康志愿者的PBMC，在使用PAM聯(lián)合IL-2特異性擴增Vγ9Vδ2-T細胞的同時，加入100μM尼古丁或PBS，每3天檢測Vγ9Vδ2-T細胞在細胞培養(yǎng)物中的比率和細胞絕對

3、數(shù)目，并于體外擴增14天后檢測其免疫表型及細胞因子表達量的變化；其后將不同處理組擴增的Vγ9Vδ2-T細胞純化后，與K562細胞按不同的靶效比（E:T）共孵育4h，經(jīng)碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色后，利用流式細胞術(shù)檢測K562細胞的死亡率；為進一步分析經(jīng)尼古丁處理后Vγ9Vδ2-T細胞殺傷腫瘤細胞能力的變化，將Vγ9Vδ2-T細胞與K562細胞共培養(yǎng)4h后，檢測Vγ9Vδ2-T細胞的免疫表型及細胞因子表達量的變化

4、情況。
　　結(jié)果：PAM聯(lián)合IL-2可于體外特異地擴增并顯著提高人Vγ9Vδ2-T細胞的活性；經(jīng)免疫磁珠法純化后，Vγ9Vδ2-T細胞純度大于97％，可用于下一步實驗；經(jīng)Western blot及免疫熒光法檢測后發(fā)現(xiàn)，在新鮮分離的Vγ9Vδ2-T細胞及體外擴增的Vγ9Vδ2-T細胞表面均表達尼古丁受體α7-nAchR；高濃度的尼古?。?mM）顯著影響Vγ9Vδ2-T細胞的生存活性，而在低濃度尼古?。?00μM）處理組中未觀察到此現(xiàn)

5、象；同時，我們發(fā)現(xiàn)100μM尼古丁可以明顯抑制 Vγ9Vδ2-T細胞的增殖活性，導(dǎo)致其擴增比率及擴增數(shù)目的顯著降低（p<0.05）；經(jīng)100μM尼古丁處理的Vγ9Vδ2-T細胞，在靶效比為10：1、20：1時，對K562腫瘤細胞的殺傷能力受到顯著抑制（p<0.05）；與 PBS對照組相比，尼古丁處理后的Vγ9Vδ2-T細胞與 K562細胞按1：1比例共孵育后，Vγ9Vδ2-T細胞的Fas配體（Factor associated suic

6、ide ligand,FasL）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosisfactor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)、CD107a及穿孔素（Perforin）的表達明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：在體外擴增的Vγ9Vδ2-T細胞中檢測到α7-nAchR受體的表達，且低濃度尼古丁（100μM）無法影響 Vγ9Vδ2-T細胞的生存活性；經(jīng)尼古丁處理后，Vγ9Vδ2-T細胞的增

7、殖能力顯著降低，更為重要的是其腫瘤殺傷能力受到明顯的抑制；通過進一步研究，我們發(fā)現(xiàn)尼古丁負調(diào)控Vγ9Vδ2-T細胞殺傷腫瘤細胞活性的主要分子機制是通過結(jié)合于細胞表面的尼古丁受體后，下調(diào)Vγ9Vδ2-T細胞表面FasL、TRAIL的表達水平；另外Vγ9Vδ2-T細胞表面CD107a表達量的下調(diào)，以及胞內(nèi)穿孔素表達水平的降低也提示我們，尼古丁也可以通過直接調(diào)控細胞毒性相關(guān)效應(yīng)因子的分泌水平，顯著破壞Vγ9Vδ2-T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。