DYC-279對人肝癌細胞株HepG-2體外抗腫瘤活性的初步研究.pdf

1、1、背景和目的:
　　1，2，3-三氮唑在藥物化學(xué)合成中占據(jù)重要地位，它具有易于合成以及生物活性較高等特點。近年研究表明，1，2，3-三氮唑類化合物具有較強的抗腫瘤活性，使此類化合物的研究成為研發(fā)抗腫瘤藥物的一個熱點。DYC-279是一種新合成的小分子化合物，具有1，2，3-三氮唑基團的二硫代氨基乙酸酯，相對分子質(zhì)量為468，對MGC-803、MCF-7、PC-3和EC-109等細胞株具有較強的抑制作用，是一種具有活性的藥物前體，

2、但其作用機制尚沒有明確的報道。本文研究了DYC-279對人肝癌細胞HepG-2的體外抗腫瘤活性，運用Western blot及PCR方法探討其干擾細胞周期及誘導(dǎo)凋亡作用的機制，并初步考察了DYC-279對CYP450酶活性的影響。
　　2、方法:
　　分別用0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5mg/L的DYC-279處理人肝癌HepG-2細胞24、48及72h后，CCK-8法檢測DYC-279對細胞的增

3、殖抑制作用;用濃度為0.78、1.56、3.13mg/L的DYC-279處理人肝癌HepG-2細胞24h后，F(xiàn)CM檢測細胞周期變化和凋亡情況;使用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測細胞周期及凋亡相關(guān)因子CyclinB1、cdc-2、CyclinD1、Caspase9、Bax及Bcl-2的mRNA或蛋白表達水平變化;使用大鼠S9體外孵育體系，分析DYC-279對CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1三種代謝酶活性的影響。

4、r>　　3、結(jié)果:
　　(1)DYC-279對細胞株HepG-2的抑制實驗
　　CCK-8法檢測結(jié)果表明DYC-279對細胞的抑制作用隨藥物濃度的增大而增大，隨藥物作用時間的延長而增加;DYC-279處理細胞24h、48h及72h后，DYC-279對人肝癌細胞株HepG-2的IC50值分別為（10.6±2.7）mg/L、（6.5±1.9）mg/L、（3.1±1.1）mg/L。
　　(2)DYC-279對HepG-2細胞

5、周期及凋亡的干擾作用
　　FCM檢測細胞周期變化顯示，隨著藥物濃度的增加，處于G0/G1期的細胞數(shù)目減少，G2/M期的明顯增加，而S期細胞數(shù)目變化不明顯。使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示，藥物作用24h后，細胞早期凋亡及晚期凋亡數(shù)目有增加的趨勢，且早期凋亡更加明顯。
　　(3)PCR技術(shù)檢測周期相關(guān)基因表達的變化
　　PCR檢測CyclinB1、cdc-2、CyclinD1基因的mRNA水平

6、結(jié)果顯示，CyclinB1、cdc-2基因的mRNA表達水平均上調(diào)，CyelinD1基因的mRNA水平顯著下調(diào)，預(yù)示著細胞周期相關(guān)基因CyclinB1、cdc-2、CyclinD1的表達受到DYC-279的影響。
　　(4)DYC-279對細胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　實驗采用Western blot方法檢測周期蛋白CyclinB1、cdc-2、CyclinD1及凋亡蛋白Caspase9、Bcl-2、Bax的表達水平

7、。實驗表明蛋白CyclinB1、cdc-2、Caspase9、Bax等的表達水平隨用藥濃度的增加而上調(diào)，蛋白CyclinD1與Bcl-2的表達水平明顯下調(diào)。
　　(5)DYC-279對CYP450酶活性的影響
　　不同濃度DYC-279與S9孵育體系中，與對照組相比，非那西丁的濃度變化不明顯，表明DYC-279對CYP1A2酶活性無影響;右美沙芬的代謝減慢，說明了DYC-279降低了CYP2D6的活性;氯唑沙宗的代謝減慢較快

8、，說明了DYC-279同樣降低了CYP2E1的活性，同時孵育體系中DYC-279的濃度越高，氯唑沙宗的代謝越慢，預(yù)示著DYC-279對CYP2E1活性的影響可能具有濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　(1)DYC-279在一定濃度下抑制人肝癌HepG-2細胞株的增殖。
　　(2)DYC-279阻滯HepG-2細胞于G2/M期并誘導(dǎo)其凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生。
　　(3)DYC-279的抗腫瘤活性可能與CyclinB1、cdc-2