膽汁酸對(duì)梗阻性黃疸腸黏膜屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)導(dǎo)致排入腸腔內(nèi)的膽汁減少甚至缺如，引起腸腔內(nèi)細(xì)菌過度生長，內(nèi)毒素釋放增多，腸上皮細(xì)胞增殖減少，凋亡增多，腸黏膜緊密連接破壞，從而造成腸黏膜屏障損傷通透性增高。腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素通過損傷的腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，引起局部及全身感染，甚至造成敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。
　　膽汁酸是膽汁的活性成分，人類膽汁酸主要包括初級(jí)膽汁酸（膽酸和鵝去氧膽酸）、次級(jí)

2、膽汁酸（石膽酸和去氧膽酸）以及它們的甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合形式。初級(jí)膽汁酸在腸道細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸。膽汁酸是一種兩性分子，其主要功能是促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的消化和吸收。此外，膽汁酸還能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸黏膜屏障的完整性。最近研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸還可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)自身生物合成，調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)、藥物和能量等代謝過程，并參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡和分化。
　　膽汁酸膜受體TGR5是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，表達(dá)于多種器官和細(xì)

3、胞，其中膽囊上皮和腸道表達(dá)最高。TGR5能夠調(diào)節(jié)代謝和膽汁酸平衡。激活TGR5可以增加能量消耗，明顯降低高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體重。TGR5可誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，增加胰島素的敏感性，調(diào)節(jié)葡萄糖平衡。與野生型小鼠相比，TGR5敲除小鼠不僅總膽汁酸池容量降低，而且可抵抗膽固醇膽囊結(jié)石形成。TGR5還可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。最近研究表明，TGR5還具有抑制細(xì)

4、胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，例如給予牛磺膽酸鹽后可活化TGR5促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的增殖。
　　本課題重點(diǎn)研究膽汁對(duì)梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜屏障的作用及TGR5的表達(dá)變化，并用動(dòng)物及細(xì)胞模型驗(yàn)證鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)是否通過上調(diào)TGR5的表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，從而保護(hù)腸黏膜屏障。
　　第一部分:膽汁對(duì)梗阻性黃疸患者腸黏膜屏障的作用及對(duì)TGR5表達(dá)的
　　影響
　　目的:觀察膽汁

5、對(duì)梗阻性黃疸患者腸黏膜及TGR5表達(dá)的影響。
　　方法:收集行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)治療的惡性膽道梗阻伴黃疸患者16例;其中接受膽管支架置入術(shù)(ERBD)進(jìn)行膽汁內(nèi)引流（internal biliary drainage，ID）的患者8例，接受鼻膽管引流術(shù)（ENBD）進(jìn)行膽汁外引流（external biliary drainage，ED）的患者8例。所有患者在治療前和治療一周后取十二指腸乳頭以下2-5 cm范圍內(nèi)腸黏膜組

6、織，觀察其形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)和Western blot方法檢測(cè)腸黏膜TGR5及增殖標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen, PCNA)的分布及表達(dá)變化。同時(shí)收集患者治療前后的血清，檢測(cè)血清中腸上皮細(xì)胞標(biāo)志酶二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid binding protein,

7、I-FABP）以及腸內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)物內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides，LPS)和D-乳酸(D-lactate)的水平。
　　結(jié)果:①光鏡下觀察HE染色結(jié)果，ID組患者與治療前相比，腸黏膜絨毛較完整，上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊，腸黏膜損傷病理學(xué)評(píng)分為0.7±0.63，顯著低于治療前（2.5±0.37，P＜0.01）。ED組患者治療前后腸黏膜形態(tài)學(xué)無明顯變化，損傷病理學(xué)評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。②電鏡下觀察腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)，

8、ID組患者與治療前相比，微絨毛排列整齊，數(shù)量增多，緊密連接間隙變窄;ED組患者治療前后，腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)無明顯變化。③血清檢測(cè)結(jié)果顯示，ID組患者治療后DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量分別為57.23±8.6 U/L，149.6±29.16 pg/ml，0.2±0.02EU/ml，1.0±0.2 mM，均較治療前顯著下降（96.12±12.51 U/L，302.5±6103 pg/ml，0.39±0.04 EU/ml

9、，1.68±0.18 mM，P＜0.05）。而ED組患者治療前后血清DAO、I-FABP、LPS、和D-lactate含量無顯著差異（P＞0.05）。④IHC顯示PCNA主要在腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)，TGR5主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜。ID組患者治療后，PCNA和TGR5的表達(dá)高于治療前，而ED組患者治療前后，PCNA和TGR5的表達(dá)無明顯差異。Westernblot分析結(jié)果與免疫組化一致，ID組患者治療后PCNA和TGR5的表達(dá)均較

10、治療前增多（P＜0.05，P＜0.01），而ED組患者治療前后PCNA和TGR5的表達(dá)無顯著差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論:膽汁能夠促進(jìn)梗阻性黃疸患者腸黏膜上皮細(xì)胞增殖，改善腸黏膜形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)，降低其通透性，并增加TGR5的表達(dá)。TGR5可能與腸上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　第二部分:膽汁酸對(duì)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜屏障的作用及對(duì)TGR5表達(dá)的影響
　　目的:建立梗阻性黃疸大鼠動(dòng)物模型，探討膽汁酸CDCA對(duì)腸黏膜屏障的作用

11、及對(duì)腸黏膜TGR5表達(dá)的影響。
　　方法:將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(sham operation，SHAM)，膽總管結(jié)扎組+溶劑組(bile duct ligated+Vehicle，BDL+Vehicle)，膽總管結(jié)扎+CDCA組(BDL+CDCA)。1周后取末端回腸黏膜組織觀察其形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變，應(yīng)用IHC和Western blot方法檢測(cè)腸黏膜TGR5、PCNA分布及表達(dá)的變化。同時(shí)，檢測(cè)血清中DA

12、O、I-FABP、LPS和D-lactate的水平。
　　結(jié)果:①HE染色結(jié)果顯示，SHAM組腸黏膜絨毛及上皮細(xì)胞排列整齊;BDL+Vehicle組腸黏膜的完整性被破壞，表現(xiàn)為小腸絨毛短粗，絨毛頂端上皮下間隙增大，上皮層與固有層分離;BDL+CDCA組腸黏膜絨毛較完整，上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊，腸黏膜損傷病理學(xué)評(píng)分為1.8±0.2，顯著低于BDL+Vehicle組（2.6±0.16，P＜0.01）。②電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)，SHAM

13、組腸黏膜微絨毛排列整齊、緊密;BDL+Vehicle組腸黏膜微絨毛明顯稀疏，緊密連接間隙增寬，胞漿有空泡形成;BDL+CDCA組腸黏膜微絨毛排列相對(duì)整齊，胞漿中未見空泡形成。③與SHAM組相比，BDL+Vehicle組血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯升高;而BDL+CDCA組與BDL+Vehicle組相比，血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明顯下降(P＜0.001)。④IHC顯示，PCN

14、A主要在細(xì)胞核表達(dá)，TGR5主要在細(xì)胞膜表達(dá)。BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)均較SHAM組下降。而與BDL+Vehicle組相比，BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)明顯升高。Western blot分析結(jié)果與免疫組化一致，BDL+Vehicle組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)均較SHAM組減少，而與BDL+Vehicle組相比，BDL+CDCA組腸黏膜PCNA和TGR5的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)

15、。
　　結(jié)論:膽汁酸CDCA能夠促進(jìn)梗阻性黃疸大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞增殖，改善腸黏膜形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)，降低其通透性，并上調(diào)TGR5的表達(dá)。TGR5可能與腸上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　第三部分:膽汁酸通過上調(diào)TGR5表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖
　　目的:探討CDCA是否通過TGR5的表達(dá)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。
　　方法:用LPS誘導(dǎo)人小腸上皮細(xì)胞株FHs74 Int損傷，作為梗阻性黃疸腸黏膜損傷的細(xì)胞模型，觀察膽汁酸CDCA刺激

16、對(duì)LPS誘導(dǎo)的FHs74Int損傷的影響。實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組(control)、CDCA組、LPS組和LPS+CDCA組。給予LPS(1 mg/ml)和/或CDCA(100μM)處理FHs74Int細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞。以慢病毒為載體在FHs74 Int細(xì)胞中敲低和過表達(dá)TGR5，觀察TGR5與腸上皮細(xì)胞增殖的關(guān)系。用RT-real time PCR及Western blot分析分別從mRNA水平及蛋白水平觀察敲低及過表達(dá)效果。在TG

17、R5敲低的FHs74 Int細(xì)胞中，應(yīng)用LPS(1 mg/ml)處理細(xì)胞48 h，實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組(Lv-shCon)、TGR5敲低組(Lv-shTGR5)、Lv-shCon+LPS和Lv-shTGR5+LPS。在TGR5過表達(dá)的FHs74 Int細(xì)胞中，應(yīng)用LPS(1 mg/ml)處理細(xì)胞48 h，試驗(yàn)分四組:對(duì)照組(Lv-Flag)、TGR5過表達(dá)組(Lv-TGR5)、Lv-Flag+LPS和Lv-TGR5+LPS。為進(jìn)一步證明C

18、DCA能夠通過TGR5促進(jìn)細(xì)胞增殖，給予LPS和/或CDCA刺激TGR5敲低的FHs74 Int細(xì)胞48 h，試驗(yàn)分四組:Lv-shCon、Lv-shCon+LPS、Lv-shCon+LPS+CDCA和Lv-shTGR5+LPS+CDCA。收集上述分組細(xì)胞，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，EdU檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況，綜合反映細(xì)胞增殖水平。應(yīng)用Western blot分析檢測(cè)PCNA及TGR5的表達(dá)。
　　結(jié)果:

19、①CCK-8分析結(jié)果表明，LPS刺激基礎(chǔ)上加入CDCA處理后，F(xiàn)Hs74 Int細(xì)胞活力顯著高于單純LPS損傷組。流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，LPS損傷基礎(chǔ)上加入CDCA處理后，較LPS損傷組，S期細(xì)胞比例上升，而G0/G1期細(xì)胞比例下降。EdU結(jié)果與CCK-8及細(xì)胞周期結(jié)果一致，LPS+ CDCA組與LPS組相比，DNA合成增加。以上結(jié)果表明，CDCA處理可對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制。Western blot分析結(jié)果表明，LPS處理可抑制

20、PCNA和TGR5表達(dá)，加入CDCA處理后，PCNA和TGR5表達(dá)較LPS損傷組顯著升高，結(jié)果提示，膽汁酸可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖及TGR5表達(dá)，二者具有一定正相關(guān)關(guān)系。②CCK-8分析結(jié)果表明，LPS刺激后，細(xì)胞活力減低，而用Lv-shTGR5敲低內(nèi)源性TGR5的表達(dá)后，細(xì)胞活力降低更為顯著。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，LPS處理后，G0/G1期細(xì)胞比例上升，S期細(xì)胞比例下降，表明細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，TGR5敲低組的G0/G1期阻滯更明顯。E

21、dU結(jié)果顯示，LPS處理后，細(xì)胞DNA合成受抑制，而TGR5敲低后，F(xiàn)Hs74 Int細(xì)胞的DNA合成進(jìn)一步被抑制。Westernblot分析表明，LPS可顯著抑制增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達(dá)，敲低TGR5可進(jìn)一步下調(diào)PCNA水平。以上結(jié)果表明，敲低TGR5促進(jìn)LPS對(duì)FHs74Int細(xì)胞增殖的抑制，提示TGR5可促進(jìn)細(xì)胞增殖。③CCK-8分析結(jié)果顯示，在TGR5過表達(dá)及對(duì)照組細(xì)胞中，LPS刺激后，細(xì)胞活力均減低，而TGR5過表達(dá)組細(xì)胞活

22、力較對(duì)照組有所升高。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，LPS處理后，G0/G1期細(xì)胞比例上升，而S期細(xì)胞比例下降，表明細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，而TGR5過表達(dá)組的G0/G1期阻滯較對(duì)照組有所減輕。EdU結(jié)果顯示，LPS處理后，細(xì)胞DNA合成受抑制，而過表達(dá)TGR5可減弱LPS誘導(dǎo)的DNA合成抑制。Western blot分析表明，LPS可顯著抑制增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達(dá)，而過表達(dá)TGR5可抑制LPS引起的PCNA下調(diào)。結(jié)果表明，過表達(dá)TGR5可減弱

23、LPS對(duì)FHs74 Int細(xì)胞增殖的抑制，提示TGR5可促進(jìn)細(xì)胞增殖。④LPS刺激后，細(xì)胞活力降低，G0/G1期細(xì)胞比例上升，S期細(xì)胞比例下降，DNA合成減少，PCNA下調(diào)，表明LPS可顯著抑制細(xì)胞增殖。在LPS損傷的FHs74 Int中加入CDCA后，細(xì)胞活力升高，G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高，DNA合成增加，PCNA上調(diào)，表明CDCA可減弱LPS對(duì)FHs74 Int的增殖抑制。而在TGR5敲低的細(xì)胞中，CDCA刺激不能