ω-3多不飽和脂肪酸對梗阻性黃疸大鼠腸損傷干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本課題首先建立梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)動物模型，予以應(yīng)用富含ω-3多不飽和脂肪酸的魚油干預(yù)，并行腹部胸導(dǎo)管置管引流淋巴液，通過對外周血液、淋巴液中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-10)、NO及高遷移率族蛋白1(HMGB1)測定，明確ω-3 PUFA干預(yù)的影響;推測上述細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)的可能來源。進(jìn)一步對比分析腸粘膜組織中HMGB1與Toll樣受體-4(TLR4)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB

2、）蛋白表達(dá)變化，明確“腸—淋巴途徑”及HMGB1等在OJ導(dǎo)致腸屏障功能損害中的作用，然后應(yīng)用富含ω-3 PUFA處理，進(jìn)一步探討ω-3多不飽和脂肪酸對OJ機(jī)體保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　第一部分:ω-3 PUFA干預(yù)梗阻性黃疸大鼠血液及淋巴液中細(xì)胞因子對比觀察
　　目的:1.改良腹部胸導(dǎo)管置管過程，建立簡潔的淋巴管置管及淋巴液引流的方法。2.對比觀察血液及淋巴液中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO及HMGB1含量變化，以

3、及ω-3 PUFA干預(yù)后的影響。
　　方法:SPF級雄性wistar大鼠72只，隨機(jī)分為:梗阻性黃疸（OJ）組(n=24)，梗阻性黃疸+ω-3 PUFA組(OJPUFA)組(n=24)及Sham組(n=24)。根據(jù)標(biāo)本收集時(shí)間的不同，再次隨機(jī)分為d3、d7及d14三組。梗阻性黃疸模型通過膽總管雙重結(jié)扎法建立，僅OJPUFA組動物自術(shù)后第1天，給予ω-3 PUFA按0.4 g.kg-1.d-1劑量灌胃，其余組動物相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)等量生理鹽

4、水灌胃作為對照。各組大鼠分別于術(shù)后第3、7、14天腹部胸導(dǎo)管置管收取淋巴液，以及下腔靜脈血液、回腸組織等標(biāo)本，分別予以置-80℃冰箱或10％中性甲醛固定后保存。利用全自動生化分析儀檢測總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等生化指標(biāo)。ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-10及HMGB1含量，硝酸還原酶（微板法）測定NO含量。
　　結(jié)果:
　　1.通過充分游離腹主動脈間接顯露腹部胸導(dǎo)管，操作過

5、程簡單，置管成功率高，收集淋巴液量相對較大，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.一般情況:本實(shí)驗(yàn)所有動物均未發(fā)生術(shù)后切口感染或切口裂開等并發(fā)癥，實(shí)驗(yàn)過程中OJ14d組死亡1只（腸梗阻），余無動物死亡。OJ與OJPUFA組大鼠術(shù)后第1-3天，體重有下降趨勢，7天以后均恢復(fù)至術(shù)前體重，但任一相同時(shí)間點(diǎn)，較Sham組體重明顯減低; d14時(shí)間點(diǎn)時(shí)OJPUFA組大鼠體重高于OJ組，且差異有顯著性(P=0.000＜0.05)，但都顯著低于Sham

6、組(P＜0.05)。
　　3.肝臟功能指標(biāo)變化:Sham組TBIL及DBIL水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有明顯變化，OJ組與OJPUFA組血清TBIL及DBIL水平自術(shù)后第3日起較Sham組明顯增高，但該兩組之間相比差異均無顯著性(P=0.786，0.790，0.881＞0.05)，(P=0.855，0.324，0.530＞0.05)。Sham組ALT及AST水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中波動幅度較小。OJ組與OJPUFA組中血清ALT及AST水

7、平，自術(shù)后第3天起較Sham組明顯增高，但差異無顯著性，隨時(shí)間推移，此二者血清水平均成進(jìn)行性升高趨勢，至術(shù)后14天，OJ組ALT及AST均顯著高于OJPUFA組(P=0.014，0.012＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.通過充分游離腹主動脈來間接顯露腹部胸導(dǎo)管，符合此二者之間的解剖關(guān)系，更有利于胸導(dǎo)管顯露，創(chuàng)傷減少，操作簡單，淋巴液引流量相對較大，可用于需要開腹手術(shù)的大鼠疾病模型中引流淋巴液的研究。
　　2.ω

8、-3多不飽和脂肪酸干預(yù)后，在一定程度上改善了大鼠體重及肝臟功能，但在膽道梗阻未解除的前提下，ω-3 PUFA干預(yù)對大鼠一般情況及肝臟功能的改善等方面作用是有限的。
　　3.ω-3多不飽和脂肪酸干預(yù)，能減弱促炎因子HMGB1、TNF-α及IL-1β的釋放，避免IL-10水平過度升高，改善OJ機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)，減弱機(jī)體大量分泌NO所介導(dǎo)的損害反應(yīng)。
　　4.TNF-α及IL-1β可能主要來源于OJ機(jī)體腸道淋巴等組織的分泌;淋巴液

9、中IL-10及NO可能不是OJ機(jī)體的主要來源。而HMGB1在膽道梗阻后早期，淋巴液中的HMGB1可能不是機(jī)體的主要來源，但隨梗阻時(shí)間延長，腸道淋巴等組織的分泌增加更為顯著。
　　第二部分:ω-3PUFA對梗阻性黃疸大鼠小腸損傷的影響及機(jī)制
　　目的:觀察ω-3 PUFA對梗阻性黃疸大鼠回腸形態(tài)學(xué)及杯狀細(xì)胞數(shù)量變化的影響;以及HMGB1/TLR4信號轉(zhuǎn)到途徑在OJ損害中的作用及可能機(jī)制。
　　方法:本研究第一部分留取的回

10、腸標(biāo)本，應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)研究。HE及AB-PAS染色觀察腸粘膜形態(tài)學(xué)及杯狀細(xì)胞變化;免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1、TLR4及NF-Kb p65在腸粘膜表達(dá)變化;qRT-PCR及Western-blot檢測回腸組織HMGB1、TLR4及NF-Kb p65 mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.腸道組織病理學(xué)變化
　　假手術(shù)組:腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰，無充血水腫，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸澗，上皮細(xì)胞完整。OJ組:自d3開始，粘

11、膜絨毛水腫逐漸加重，間質(zhì)可見充血，炎性細(xì)胞浸潤逐漸增多，絨毛之間的間隙逐漸增大，粘膜高度逐漸降低，腺窩深度變淺，開口逐漸增寬，絨毛長度與腺窩深度的比例逐漸降低，在d14時(shí)間點(diǎn)，絨毛顯著縮短，可見部分絨毛上皮細(xì)胞脫落缺失明顯，部分區(qū)域潰瘍形成。OJPUFA組，在d3、d7時(shí)間點(diǎn)，肉眼觀無明顯差別，至d14時(shí)間點(diǎn)可見絨毛粗短，但結(jié)構(gòu)相對完整，絨毛脫落及潰瘍形成少見。對第14天，小腸絨毛高度、隱窩深度以及二者的比值進(jìn)一步對比可見，假手術(shù)組絨毛

12、高度顯著高于OJ組及OJPUFA組，且以O(shè)J組降低更為顯著，與OJPUFA組相比(P=0.000＜0.05);在隱窩深度方面的變化趨勢與絨毛高度變化趨勢相近;而對于絨毛高度/隱窩深度比值方面，假手術(shù)組顯著高于OJ組及OJPUFA組(P＜0.05)，差異有顯著性。盡管OJPUFA組高于OJ組，但二者比較無顯著性差異(P=0.107＞0.05)。
　　2.AB-PAS染色顯示回腸杯狀細(xì)胞吸光度值變化
　　Sham組大鼠中，小腸杯

13、狀細(xì)胞呈藍(lán)染，均勻分布于腸黏膜上皮內(nèi)，細(xì)胞飽滿，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異。而OJ組和OJPUFA組大鼠，腸絨毛水腫顯著，在d3時(shí)間點(diǎn)杯狀細(xì)胞吸光度值稍高于假手術(shù)組，在d7、d14時(shí)間點(diǎn)杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，均顯著低于任一相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組含量，且OJ組下降更為明顯，在d14時(shí)間點(diǎn)，顯著低于OJPUFA組水平(P=0.035＜0.05)。
　　3.回腸組織中HMGB1，TLR4及NF-κb p65蛋白表達(dá)變化
　　3.1 HMGB

14、1
　　Sham組大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)僅見少許淡黃色顆粒，在任何時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均不顯著。而OJ和OJPUFA組在d3時(shí)間點(diǎn)就可見顯著黃染，染色陽性區(qū)域主要位于絨毛頂端，主要位于腸粘膜上皮細(xì)胞核內(nèi)，胞漿內(nèi)表達(dá)少，同時(shí)間質(zhì)中的炎癥細(xì)胞也可見陽性表達(dá)。d7時(shí)間點(diǎn)，OJ組整個(gè)絨毛上皮細(xì)胞的胞核及胞漿均可見明顯黃染，間質(zhì)中的炎癥性細(xì)胞的表達(dá)量亦明顯增加;而OJPUFA組的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)，也呈現(xiàn)彌漫性表達(dá)增強(qiáng)。在d14時(shí)間點(diǎn)，在OJ組中

15、HMGB1表達(dá)也顯著增強(qiáng)，腸粘膜上皮細(xì)胞胞核、胞漿甚至胞外都可見明顯棕黃色乃至棕褐色顆粒沉著，間質(zhì)中的炎癥細(xì)胞也呈現(xiàn)相同的染色結(jié)果。OJPUFA組也有相似變化趨勢，但染色程度明顯變淺。
　　3.2 TLR4
　　Sham組大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞膜表面未見明顯黃染。OJ和OJPUFA組在d3肘間點(diǎn)就可見少許黃染，位于絨毛頂端，在d7時(shí)間點(diǎn)，OJ組腸上皮細(xì)胞膜表面可見明顯黃染，間質(zhì)中的炎癥性細(xì)胞也可見少許陽性表達(dá);在d14時(shí)間點(diǎn)，O

16、J組腸絨毛頂端細(xì)胞膜顯著黃染，致部分上皮細(xì)胞膜清晰可見;而OJPUFA組陽性表達(dá)程度明顯弱于OJ組。Western-blot顯示，Sham組大鼠TLR4始終維持于較低水平，與免疫組化染色結(jié)果一致。d3時(shí)間點(diǎn)開始，OJ組和OJPUFA組大鼠小腸內(nèi)TLR4的含量均顯著高于假手術(shù)組，且表達(dá)量逐漸增多，OJ組變化最為顯著。在d14，OJ組小腸內(nèi)TLR4的水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.000＜0.05)。
　　3.3 NF-κb p

17、65
　　Sham組大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞核內(nèi)僅見少許淡黃色顆粒，OJ組和OJPUFA組在d3、d7時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞核內(nèi)可見顯著黃染，染色陽性區(qū)域彌漫分布于整個(gè)絨毛，陽性表達(dá)主要位于腸粘膜上皮細(xì)胞核內(nèi)，胞漿內(nèi)表達(dá)少，間質(zhì)中的炎癥細(xì)胞也可見陽性表達(dá)。在d14時(shí)間點(diǎn)，OJ組腸粘膜上皮細(xì)胞的胞核及胞漿內(nèi)均可見明顯黃染甚至棕褐色顆粒，并呈片狀連續(xù)性、強(qiáng)陽性表達(dá)，整個(gè)絨毛及隱窩區(qū)內(nèi)上皮細(xì)胞胞漿及胞核均可見明顯黃染，并且間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的表達(dá)量也明顯增

18、加。而OJPUFA組的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)，也呈現(xiàn)彌漫性表達(dá)增強(qiáng)，胞漿陽性表達(dá)程度相對較弱，間質(zhì)中炎癥細(xì)胞胞核及胞漿也有陽性表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　ω-3PUFA可改善梗大鼠阻性黃疸導(dǎo)致的腸絨毛高度減退，改善絨毛高度/隱窩深度比值，減弱梗阻性黃疸機(jī)體中腸粘膜上皮的損害，并可改善腸粘膜上皮中杯狀細(xì)胞的數(shù)量和功能。梗阻性黃疸可促進(jìn)大鼠腸管組織中HMGB1/TLR4/NF-κ B通路的活化，損害腸粘膜屏障功能;ω-3多不飽和脂