重水標(biāo)記法測(cè)定大鼠日糧賴氨酸攝入量對(duì)血液白蛋白代謝動(dòng)力學(xué)的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本課題主要分為兩部分，第一部分以2H2O作為示蹤劑標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)白蛋白，以期建立2H2O標(biāo)記丙氨酸的檢測(cè)方法，為研究蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)合成率提供方法保證;第二部分為研究在日常飲食狀態(tài)下，大鼠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)攝入含有低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)賴氨酸飼料，血液白蛋白的代謝動(dòng)力學(xué)是否一致，白蛋白的分?jǐn)?shù)合成率是否相同，分析血漿白蛋白代謝動(dòng)力學(xué)指標(biāo)是否對(duì)賴氨酸攝入量敏感，為進(jìn)一步研究對(duì)賴氨酸攝入量較敏感的檢測(cè)指標(biāo)建立

2、方法體系，從而為確定人體賴氨酸需要量的研究奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分
　　(1)重水短時(shí)間(90min)標(biāo)記大鼠，分離血漿。
　　(2)采用三氯乙酸/乙醇法對(duì)大鼠血液白蛋白進(jìn)行初步提純，并清除表面殘留游離氨基酸。
　　(3)經(jīng)SDS-PAGE鑒定提純蛋白為白蛋白。
　　(4)酸水解法水解白蛋白，收集水解后丙氨酸，同時(shí)收集血液游離丙氨酸。
　　(5)對(duì)兩種來(lái)源丙氨酸進(jìn)行分離和純化。<

3、br>　　(6)對(duì)丙氨酸進(jìn)行衍生化處理，經(jīng)GC/MS檢測(cè)，確定了重水標(biāo)記丙氨酸檢測(cè)方法的可行性。
　　第二部分
　　(1)參考AIN-93G各成分比例設(shè)計(jì)大鼠純化飼料，三種飼料賴氨酸含量分別為低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)。生產(chǎn)后隨即檢測(cè)飼料氨基酸組分。
　　(2)健康成年雄性SD大鼠72只，12周齡，體重320g左右，隨機(jī)分為3組，每組24只。分別給予低賴氨酸(0.2％)飼料、正常賴氨酸(0.9％)

4、飼料和高賴氨酸(1.6％)飼料，其他營(yíng)養(yǎng)成分均按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)給予，喂養(yǎng)8w，自由進(jìn)食。
　　(3)自第9周開始，給予每組大鼠2H2O以標(biāo)記血液游離丙氨酸、血液白蛋白，標(biāo)記至18周結(jié)束。18周內(nèi)的每周最后一天稱量大鼠體重并記錄每組每周進(jìn)食量。
　　(4)在8，9，11，13，14，18周處死大鼠，收集血液，作為樣本，用ALB試劑盒檢測(cè)血液白蛋白含量，三氯乙酸/乙醇法提純血液白蛋白并用S DS-PAGE電泳鑒定、將提純的白蛋白水解、

5、分離純化其中的丙氨酸、并將丙氨酸衍生，用GC/MS檢測(cè)血液白蛋白中的2H-丙氨酸的豐度和血漿游離丙氨酸中2H的豐度。
　　(5)分別繪制各組大鼠血液白蛋白中2H示蹤劑的變化趨勢(shì)圖，計(jì)算2H標(biāo)記白蛋白的代謝動(dòng)力學(xué)方程和蛋白質(zhì)的合成率，比較不同膳食賴氨酸組所得結(jié)果的異同，分析不同賴氨酸攝入水平對(duì)機(jī)體白蛋白代謝動(dòng)力學(xué)具有怎樣的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　腹腔注射重水90min后，3只大鼠血漿白蛋白中丙氨酸衍生

6、物的分子量為144、159基團(tuán)的豐度均可測(cè)出，且結(jié)果具有一致性。
　　第二部分
　　(1)經(jīng)檢測(cè)，三種飼料中賴氨酸含量分別為:0.23g/100g、0.89 g/100g、1.61 g/100g，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　(2)低劑量賴氨酸能明顯減少大鼠的進(jìn)食量，高劑量賴氨酸組大鼠的進(jìn)食量與正常賴氨酸組無(wú)差別。
　　(3)三組大鼠體重均值具有顯著性差異，由小到大排序依次為:低劑量賴氨酸組，正常劑量賴氨酸組，高劑量賴氨酸

7、組。
　　(4)低劑量賴氨酸組血漿白蛋白含量與正常劑量賴氨酸組無(wú)差別，高劑量賴氨酸組血漿白蛋白含量顯著高于正常劑量賴氨酸組和低劑量賴氨酸組。
　　(5)低劑量賴氨酸組的血漿白蛋白分?jǐn)?shù)合成率為13.8％，正常劑量賴氨酸組血漿白蛋白分?jǐn)?shù)合成率為15.3％，高劑量賴氨酸組血漿白蛋白分?jǐn)?shù)合成率為35.5％。
　　(6)白蛋白合成動(dòng)力學(xué)方程為:低劑量賴氨酸組ft=1.0737×(1-e0.138t);正常劑量賴氨酸組ft=1.0

8、510×(1-e0.153t);高劑量賴氨酸組ft=0.9878×(1-e-0.355t)。
　　結(jié)論:
　　(1)腹腔注射重水90min后，即能檢測(cè)出血漿白蛋白中的丙氨酸被氘標(biāo)記，說(shuō)明該方法能夠成功標(biāo)記血漿白蛋白，符合本研究需要。
　　(2)在18周實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，以正常賴氨酸(0.9％)攝入量大鼠的血漿白蛋白分?jǐn)?shù)合成率為對(duì)照，低賴氨酸(0.2％)攝入量使大鼠血漿白蛋白分?jǐn)?shù)合成率略有降低，高賴氨酸(1.6％)攝入量會(huì)明顯提