虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素的基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、虎紋捕鳥(niǎo)蛛(Ornithoctonus huwena)是分布在我國(guó)云南和廣西省的一種毒蜘蛛。它的毒液是由許多生物活性成份組成的復(fù)雜混合物，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽組學(xué)方法從粗毒中已經(jīng)鑒定了90種蛋白質(zhì)和47種多肽，但這僅僅為粗毒中的部分高豐度組份。為了克隆虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒腺中編碼多肽和蛋白質(zhì)的基因，我們使用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)，構(gòu)建了毒腺的定向全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。隨機(jī)測(cè)序后獲得468個(gè)EST，通過(guò)聚類(lèi)分析，可分成69個(gè)族：24個(gè)族是重疊群(

2、每個(gè)群包括2個(gè)EST以上)和65個(gè)族是單態(tài)(每個(gè)族只包括1個(gè)EST)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，其中68％的EST屬于的毒素轉(zhuǎn)錄子；13％的EST屬于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄子；19％的EST屬于新的轉(zhuǎn)錄子。所有毒素轉(zhuǎn)錄子編碼67個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)，即67個(gè)前體肽。根據(jù)前體肽序列的差異，除了HWTX-Ⅺ和HWTX-ⅩⅢ外，它們能被分成8個(gè)超家族：即HWTX-Ⅰ超家族、HWTX-Ⅱ超家族、HWTX-Ⅹ超家族、HWTX-ⅩⅣ超家族、HWTX-ⅩⅤ超家族、HW

3、TX-ⅩⅥ超家族、HWTX-ⅩⅦ超家族和HWTX-ⅩⅧ超家族。67個(gè)前體肽能被推導(dǎo)出43個(gè)成熟肽，序列中含半胱氨酸殘基豐富，因此命名為半胱氨酸結(jié)毒素(CKT)，其中31個(gè)是新的成熟肽。非毒素轉(zhuǎn)錄子編碼41個(gè)蛋白質(zhì)，它們是細(xì)胞蛋白質(zhì)或別的非CKT分子，用真核生物正向同源群(KOG)和基因本體論(GO)注釋了這些蛋白質(zhì)。通過(guò)毒腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)和毒液蛋白組學(xué)比較發(fā)現(xiàn)：僅僅15個(gè)CKT分子同時(shí)存在于毒腺轉(zhuǎn)錄組和毒液蛋白質(zhì)組中；29個(gè)編碼CKT的轉(zhuǎn)錄子

4、只在轉(zhuǎn)錄組中被發(fā)現(xiàn)，而它們的翻譯產(chǎn)物在毒液蛋白質(zhì)組中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。用兩種方法卻沒(méi)有鑒定到一個(gè)相同分子量的細(xì)胞蛋白質(zhì)或其它毒液成分。此外，首次在蜘蛛毒腺中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼EF-hand蛋白質(zhì)(命名為HWEFHP1)的轉(zhuǎn)錄子重疊群，它功能可能與毒素從毒腺組織分泌到毒液有關(guān)。
　　 當(dāng)前關(guān)于蜘蛛毒素基因組DNA的報(bào)道很少。為了深入的研究虎紋捕鳥(niǎo)蛛中編碼毒素的基因組DNA是否具有普遍的無(wú)內(nèi)含子特性，我們根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)特異或簡(jiǎn)并的引物，

5、克隆并分析了編碼三個(gè)超家族毒素(HWTX-Ⅺ超家族、HWTX-ⅩⅦ超家族和HWTX-ⅩⅧ超家族)的DNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的基因組DNA中都不存在內(nèi)含子。此外，也從基因組DNA中克隆到19個(gè)編碼毒素的新基因。
　　 為了盡可能多的鑒定到HWTX-Ⅺ的亞型，我們?cè)O(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行了定向PCR、克隆和進(jìn)化分析?？寺〉骄幋a38個(gè)HWTX-Ⅺ前體肽亞型的cDNA序列，這是虎紋捕鳥(niǎo)蛛中成員最多的超級(jí)族，推導(dǎo)形成31個(gè)成熟肽；HW11c2

6、1、HW11c25、HW11c40、HW11c50和HW11c10等在HWTX-Ⅺ的進(jìn)化上可能具有重要意義。
　　 隨著環(huán)境的改變，蜘蛛的種類(lèi)和數(shù)量越來(lái)越少，僅靠天然資源遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足對(duì)毒素的全面研究和開(kāi)發(fā)利用的需要。采用表達(dá)質(zhì)粒pVT102U/α在釀酒酵母S78中表達(dá)HWTX-Ⅺ的產(chǎn)率達(dá)到每升12.5mg。為了探討這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是否能成一個(gè)表達(dá)蜘蛛毒素的通用系統(tǒng)，我們克隆并表達(dá)了20個(gè)編碼毒素樣多肽的基因。最后，成功的表達(dá)出11個(gè)毒

7、素基因。對(duì)這些表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的動(dòng)物水平和細(xì)胞水平的功能研究。HW11c4在10μM的濃度下能抑制約50％的Kv1.1電流；HWTX-ⅩⅦb1在10μM的濃度下對(duì)大鼠DRG細(xì)胞上的高電壓激活的鈣通道有明顯的抑制作用；HW11c4、HW11c27和HW11c27m對(duì)trypsin有很強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)chymotrysin和thrombin也有明顯的抑制作用；其它的表達(dá)產(chǎn)物活性很弱或者還沒(méi)有找到生物學(xué)活性。
　　 此外，為從虎紋