棉酚對人食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞體外增殖抑制作用和機(jī)制及其在裸鼠模型體內(nèi)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 棉酚對人食管癌SEG-1細(xì)胞體外增殖抑制作用及其機(jī)制研究
　　目的與方法：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用臺盼藍(lán)染色法觀察棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的抗增殖作用。
　　2.本實(shí)驗(yàn)采用Wright-Giemsa染色、Hoechst33258熒光顯微鏡、透射電鏡檢查棉酚作用的食管癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、瓊脂糖凝膠電泳分析棉酚作用食管癌細(xì)胞后DNA有無梯狀帶型、流式細(xì)胞檢查細(xì)胞中DNA含量定量

2、分析細(xì)胞凋亡情況等方法來了解棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　3.通過測定caspase-9、caspase-3活性及流式細(xì)胞儀分析Bcl-2、Bcl-xL在棉酚作用前后的表達(dá)變化，探討棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　4.本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的細(xì)胞周期在棉酚干預(yù)前后的變化，探討棉酚對SEG-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　醋酸棉酚、單醛棉

3、酚不同濃度對SEG-1細(xì)胞生長均存在不同程度的抑制作用，且與藥物濃度及作用時(shí)間密切相關(guān)。1μM醋酸棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用較弱。醋酸棉酚、單醛棉酚濃度達(dá)到10μM時(shí)，SEG-1細(xì)胞生長被完全抑制，在培養(yǎng)72 h時(shí)，細(xì)胞呈負(fù)生長狀態(tài)。當(dāng)濃度低于10μM時(shí)，相同濃度下，單醛棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用明顯強(qiáng)于醋酸棉酚(P＜0.05);當(dāng)濃度高于10μM時(shí)，相同濃度下，單醛棉酚對SEG-1細(xì)胞生長抑制作用弱于醋酸棉酚(P＜0.05

4、)。單醛棉酚在SEG-1細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)的IC50值均低于醋酸棉酚(P＜0.05)。
　　Wright-Giemsa染色普通光鏡觀察到SEG-1細(xì)胞經(jīng)0.1％DMSO處理后細(xì)胞，呈多變形，邊緣清晰，形態(tài)和狀態(tài)良好，細(xì)胞間排列緊密，規(guī)整有序，貼壁生長，有個(gè)別凋亡細(xì)胞。隨著棉酚劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)改變明顯，細(xì)胞間隙逐漸增大，細(xì)胞數(shù)逐漸減少;胞體回縮變圓，胞漿內(nèi)空泡、漂浮樣改變細(xì)胞增多。
　　Hoechst3325

5、8熒光顯微鏡可見正常細(xì)胞核呈彌散均勻的微弱藍(lán)色熒光。而經(jīng)單醛棉酚處理12h，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有濃染致密的顆粒狀強(qiáng)藍(lán)色熒光，細(xì)胞質(zhì)中并有凋亡小體散在分布。
　　透射電鏡觀察到正常細(xì)胞線粒體較多，形態(tài)正常，核染色質(zhì)呈絮點(diǎn)狀，均勻分散;經(jīng)25μM單醛棉酚處理12h后，多數(shù)線粒體腫脹變圓，嵴結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、部分成塊;經(jīng)25μ M單醛棉酚處理24h后，大部分線粒體呈空泡狀，嵴結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均消失，細(xì)胞核變形，塊狀染

6、色質(zhì)向核膜靠攏。
　　瓊漿電泳分析可觀察到:DMSO處理組未出現(xiàn)DNA梯狀帶，DNA集中在加樣孔附近，未出現(xiàn)彌散，是基因組DNA的表現(xiàn)。而經(jīng)棉酚處理后出現(xiàn)梯狀條帶，說明棉酚能導(dǎo)致食管癌細(xì)胞DNA的片段化，能誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。
　　細(xì)胞內(nèi)DNA含量測定:在5μM、10μM、25μM醋酸棉酚和單醛棉酚處理24 h、48h時(shí)測定二倍體細(xì)胞比例，結(jié)果顯示醋酸棉酚和單醛棉酚，隨著濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高(P＜0.05)，而單

7、醛棉酚在相同濃度相同處理時(shí)間情況下的細(xì)胞凋亡率明顯高于醋酸棉酚(P＜0.05)。
　　細(xì)胞凋亡的酶學(xué)分析:兩種棉酚均可引起SEG-1細(xì)胞內(nèi)caspase-9、caspase-3活性升高，在處理后6h內(nèi)活性升高顯著，隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6hcaspase-9活性顯著高于單醛棉酚，而在處理后18h、24h明顯低于單醛棉酚，說明醋酸棉酚在處理后早期caspase-9活性升高快，但6h后降得也快，而單醛棉酚處理6h后caspase

8、-9活性下降較慢;caspase-3活性在處理后12h內(nèi)活性升高顯著，隨后逐漸降低。醋酸棉酚處理后6h、12h時(shí)caspase-3活性顯著高于單醛棉酚，而在處理后18 h、24 h明顯低于單醛棉酚。
　　Bcl-2家族蛋白分析:醋酸棉酚和單醛棉酚處理后Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)水平明顯降低，以DMSO處理的Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量設(shè)定為100％，醋酸棉酚處理組Bcl-2表達(dá)量下降69.4％，單醛棉酚處理組Bcl-2表達(dá)量下

9、降70.8％;醋酸棉酚處理組Bcl-xL表達(dá)量下降54.0％，單醛棉酚處理組Bcl-xL表達(dá)量下降39.5％。
　　細(xì)胞周期分析:應(yīng)用不同濃度的醋酸棉酚或單醛棉酚處理SEG-1細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期變化較小，但當(dāng)處理時(shí)間延長至48h后，SEG-1細(xì)胞有不同程度的G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，對G2期影響較小，提示醋酸棉酚能使食管癌細(xì)胞停滯在G1期，細(xì)胞進(jìn)入增殖期減少，DNA合成速度減慢。醋酸棉酚25μM處理48h后因亞二倍體或碎片

10、細(xì)胞增多，影響周期分析，因此未對該濃度處理的細(xì)胞進(jìn)行分析。而單醛棉酚則使食管癌細(xì)胞G2期細(xì)胞的增多，G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞無明顯影響，提示單醛棉酚主要使食管癌細(xì)胞停滯在G2期，抑制其增殖。單醛棉酚25μM處理48h的細(xì)胞周期分布與DMSO對照組比較無明顯差異
　　結(jié)論：
　　1.帛酚可有效抑制食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的增殖，且存劑量-時(shí)間效應(yīng)。而單醛棉酚的作用強(qiáng)于醋酸棉酚。
　　2.棉酚可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞系SEG-1

11、細(xì)胞的凋亡，且存劑量-時(shí)間效應(yīng)，單醛棉酚的誘導(dǎo)凋亡作用強(qiáng)于醋酸棉酚。這種作用可能與caspase-9、caspase-3的激活及Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)降低相關(guān)。
　　3.棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，醋酸棉酚、單醛棉酚可分別使細(xì)胞阻滯在G1期、G2期。
　　第二部分 棉酚對食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞裸鼠模型體內(nèi)作用的研究
　　目的與方法：
　　探討棉酚在食管癌細(xì)胞系SEG-1細(xì)胞裸

12、鼠模型體內(nèi)的作用。取健康SPF級BALb/c雌性裸鼠30只，分為6組，即醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組、空白對照組、陰性對照組，每組5只，空白組未接種及棉酚處理，其余5組均接種SEG-1細(xì)胞，醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組和單醛棉酚60mg/kg組分別在接種腫瘤后第3天給予相應(yīng)劑量棉酚處理，觀察各組腫瘤體積和重量的變化，

13、計(jì)算腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延遲時(shí)間，觀察裸鼠接種后體重變化，解剖測量肝、脾重量的變化。
　　結(jié)果：
　　一般情況:裸鼠在接種前生活狀態(tài)始終正常、食欲旺盛、行動(dòng)自如。皮下接種SEG-1細(xì)胞1×107個(gè)細(xì)胞后第1天即出現(xiàn)精神萎靡、飲食不振、體毛聳立等癥狀，繼而行動(dòng)遲緩直至死亡。裸鼠在接種細(xì)胞第4天時(shí)皮下出現(xiàn)肉眼可見的明顯腫塊，腫塊逐漸增大，裸鼠存活時(shí)間為(13.0±1.0)天。死亡后解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤灶與周圍組織粘連，部分裸鼠腹腔有

14、腹水，肝脾腫大。腫塊解剖后制作成細(xì)胞懸液，染色后于顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與SEG-1細(xì)胞一致。
　　病理檢查:醋酸棉酚40 mg/kg組代表給藥組腫瘤與陰性對照組裸鼠的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行病理對照。給藥組腫瘤大小及浸潤范圍均小于陰性對照組，腫瘤分化稍好于陰性對照組，腫瘤血管形成較陰性對照組差。
　　腫瘤生長變化:各給藥組裸鼠皮下腫塊均出現(xiàn)不同程度的縮小、腫塊生長速度減慢。腫瘤生長抑制率:醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60m

15、g/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組分別為14.3％、31.2％、33.7％、32.9％(P＜0.05)，醋酸棉酚40mg/kg組腫瘤生長延遲天數(shù)比醋酸棉酚60mg/kg組、單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組少1天。陰性對照組裸鼠接種SEG-1細(xì)胞后13天后體重顯著超過未接種SEG-1細(xì)胞的裸鼠。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后第1天開始出現(xiàn)活動(dòng)減少，逐

16、漸消瘦，醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠體重在用藥第5天開始顯著低于陰性對照組，醋酸棉酚40mg/kg組裸鼠體重在用藥第6天開始顯著低于陰性對照組。單醛棉酚40mg/kg組、單醛棉酚60mg/kg組裸鼠經(jīng)腹腔注射醋酸棉酚后體重變化與陰性對照組基本一致。
　　棉酚對裸鼠肝、脾重量及生存期的影響:在接種腫瘤后第10天、死亡時(shí)解剖裸鼠發(fā)現(xiàn)，未接受棉酚干預(yù)的陰性對照組裸鼠肝臟較正常裸鼠肝臟明顯增重，說明SEG-1腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移;給予4

17、0mg/kg醋酸棉酚干預(yù)的接種裸鼠肝臟重量明顯低于陰性對照組，而給予40mg/kg或60mg/kg甲醛棉酚干預(yù)的裸鼠肝臟較對照組并沒有減輕。醋酸棉酚40mg/kg組、醋酸棉酚60mg/kg組裸鼠生存時(shí)間明顯短于陰性對照組。醋酸棉酚雖有良好的抗腫瘤作用，但同時(shí)也使裸鼠生存時(shí)間縮短，說明醋酸棉酚毒性作用比單醛棉酚大。而單醛棉酚在確保較強(qiáng)的抗腫瘤作用的同時(shí)，無明顯的毒副作用，可延長裸鼠的生存期。
　　結(jié)論：
　　1.醋酸棉酚、單醛