丹參酮ⅡA對(duì)人食管癌細(xì)胞系Eca-109增殖抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景;
　　據(jù)報(bào)道，在我國(guó)每年死于食管癌的人數(shù)約為21萬人，男性人數(shù)多于女性，40歲以上的發(fā)病率高，它嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的健康和生命[1]。其治療方法主要有手術(shù)切除、腫瘤的放療和化療等，單一的任何一種方法都不是理想的，因此多采用綜合治療，在手術(shù)切除后配合藥物化療?，F(xiàn)在的化療新藥層出不窮，但因化療產(chǎn)生的副反應(yīng)仍然較大，并且耐藥性不斷增加，病人的的5年存活率依然很低。因此，利用我國(guó)的優(yōu)勢(shì)，研究中藥及其提取的有效成分在腫瘤治療方面的

2、作用是以后發(fā)展的方向之一。本研究探討了食管癌可能的發(fā)生機(jī)制及中藥丹參中的揮發(fā)油-丹參酮ⅡA（TanⅡA）對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca-109的作用。
　　Ta nⅡA是中藥丹參的主要成分。丹參酮在臨床上已被廣泛應(yīng)用于非腫瘤領(lǐng)域，主要用來治療心血管疾病，在抗菌消炎等[1]方面也有顯著療效。近年來，學(xué)者對(duì)丹參酮IIA的抗腫瘤活性產(chǎn)生了極大興趣，并進(jìn)行了多種腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外試驗(yàn)，但對(duì)食管癌的抗癌作用卻鮮見報(bào)道。
　　目的；
　　通

3、過對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞的培養(yǎng)，用不同濃度的TanⅡA干預(yù)其生長(zhǎng)，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討 TanⅡA促進(jìn) Eca-109細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為 TanⅡA更深入的研究做準(zhǔn)備。
　　方法：
　　1．MTT法：通過培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞，用不同劑量的TanⅡA作用于Eca-109細(xì)胞，通過四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）測(cè)定各組的吸光值（OD值），并計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖抑制率，繪制增殖抑制率曲線。
　　2．顯微

4、形態(tài)觀察：藥物組細(xì)胞和正常組細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，在顯微鏡下觀察正常細(xì)胞和藥物干預(yù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。
　　3．細(xì)胞熒光觀察：藥物組細(xì)胞和正常組細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，應(yīng)用AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　4．流式細(xì)胞術(shù)：采用140μg/ml、160μg/ml的TanⅡA干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)24和48小時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照，用流式檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。
　　5．免疫蛋白印跡法：采用140μg/ml、16

5、0μg/ml的TanⅡA干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)，提取細(xì)胞的總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，采用蛋白免疫印跡技術(shù)（western blot）檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、CyclinA和CDK2的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，用BIO-RAD軟件分析條帶的灰度值。
　　結(jié)果：
　　1．MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：正常組細(xì)胞活力明顯高于藥物組，并且在一定的范圍內(nèi)，隨藥物的濃度增加，細(xì)胞的活力下降，最高的抑制率可達(dá)66.16

6、4％，與陰性對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　2．顯微鏡觀察顯示：經(jīng)過 Ta nⅡA處理后的細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比較，藥物組細(xì)胞有明顯的凋亡形態(tài)的改變，出現(xiàn)細(xì)胞漂浮，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞出現(xiàn)“小泡”現(xiàn)象。
　　3．細(xì)胞熒光觀察結(jié)果顯示：與正常組細(xì)胞相比較，藥物組細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)著綠色或紅色并呈固縮狀、圓珠狀。
　　4.流式結(jié)果表明：1)140μg/ml TanⅡA干預(yù) Eca-109細(xì)胞24小時(shí)

7、后，結(jié)果顯示 S期的細(xì)胞數(shù)升高，達(dá)到54.47%；同時(shí) G0/G1期的細(xì)胞數(shù)下降，由51.317%降至41.787%，與陰性對(duì)照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。2)采用140μg/ml和160μg/ml的TanⅡA培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，結(jié)果顯示藥物組凋亡指數(shù)隨著藥物濃度的增加，凋亡指數(shù)增大，由陰性的8.319增加到TanⅡA140、160μg/ml組的31.982和52.937。用藥組和陰性對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0

8、.01）。
　　5.Western blot結(jié)果顯示：藥物培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)CyclinA、CDK2表達(dá)量降低；Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)量上升，和正常組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．TanⅡA可以抑制人食管癌細(xì)胞的增殖活力，并且這種抑制作用隨藥物濃度的增加會(huì)更明顯。
　　2．在 TanⅡA作用于食管癌細(xì)胞系 Eca-109的過程中，隨著藥物濃度的升高，細(xì)