Apigenin對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系CAOV3的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本研究通過觀察apigenin在阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡等抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面的顯著藥理作用，為研究apigenin作為一種新的化療藥物提供理論依據(jù)。并且為進(jìn)一步探討飲食結(jié)構(gòu)與卵巢癌的關(guān)系，以及通過選擇合理的飲食結(jié)構(gòu)，尋找切實(shí)可行的卵巢癌預(yù)防手段提供依據(jù)。 研究方法： 1、用倒置相差顯微鏡、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM

2、)法，觀察apigenin對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖的影響。用倒置相差顯微鏡觀察10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比較，CAOV3細(xì)胞的形態(tài)變化。用MTT方法，分析10、20、40、80、160μM apigenin作用CAOV3細(xì)胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3細(xì)胞24h，48h，72h后與對(duì)照組相比，CAOV3細(xì)胞的生長情況。用FCM方法，分析lO、20、40、8

3、0、160μM apigenin作用CAOV3細(xì)胞24h、48h后，CAOV3細(xì)胞周期的變化情況。 2、用免疫組織化學(xué)(streptavidin，SP)、逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot方法，分析apigenin對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖抑制的作用機(jī)制。用SP方法觀察80gMapigenin作用CAOV3細(xì)胞72

4、h后與對(duì)照組相比，CAOV3細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)。用RT-PCR方法分析10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3細(xì)胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3細(xì)胞24h，48h，72h后與對(duì)照組相比，apigenin對(duì)的CAOV3細(xì)胞中survivin、p21、caspase-3和VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄的影響。用Western blot方法分析apigenin對(duì)CAOV3細(xì)胞中survivin

5、、p21和caspase-3蛋白表達(dá)的影響。 3、用SP法和RT-PCR方法分析survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表達(dá)情況。用SP法分析38例卵巢癌組織和8例正常卵巢中survivin和VEGF蛋白的表達(dá)情況。用RT-PCR方法分析20例卵巢癌組織和4例正常卵巢中survivin和VEGFmRNA的表達(dá)情況。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料用成組比較t檢驗(yàn)，計(jì)

6、數(shù)資料用X<'2>檢驗(yàn)，用Spearman和Pearson進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 研究結(jié)果： 1、觀察apigenin對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖的影響。10、20、40、80、160gM apigenin作用CAOV3細(xì)胞48h后與對(duì)照組相比，隨著藥物劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞間隙逐漸增寬，細(xì)胞體積逐漸縮小，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多。160μM時(shí)，可見大量壞死細(xì)胞碎片。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞

7、外觀呈長梭行，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻。MTT結(jié)果：10、20、40、80、160μMapigenin抑制率分別為2.7％，9.0％，24.5％，42.8％，63.8％，隨著劑量增加抑制率逐漸增加(P<0.01)。并且80μMapigenin作用CAOV3細(xì)胞24h，48h，72h后，抑制率分別為13％，43％，68％，隨著時(shí)間延長抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.01)。隨著apigenin劑量的增加和作用時(shí)間的延長，CAOV3細(xì)胞的增殖抑

8、制越來越明顯，表現(xiàn)出良好的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。FCM結(jié)果：10、20、40、80gMapigenin作用CAOV3細(xì)胞24h后，G2/M期細(xì)胞比例由6.45％逐漸升高到43.17％，G0/G1期與S期所占百分比逐漸減少，表現(xiàn)出G2/M期阻滯。Apigenin作用48h后，G2/M期細(xì)胞所占百分比由0.49％升到63.2％，G0/G1期與S期所占百分比明顯減少，G2/M期阻滯較24h更加明顯。并且80gMapigenin作用24、48

9、h均出現(xiàn)凋亡峰，即亞G1期細(xì)胞(凋亡細(xì)胞群)。 2、分析apigenin對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖抑制的作用機(jī)制。免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組CAOV3細(xì)胞的胞漿內(nèi)幾乎全部可見棕黃色顆粒，即survivin蛋白表達(dá)陽性。80gMapigenin作用CAOV3細(xì)胞72h后，survivin蛋白仍然表達(dá)，但是表達(dá)強(qiáng)度明顯下降。RT-PCR和Western Not結(jié)果顯示：隨著apigenin劑量的增加和作用時(shí)間的延長，CAOV3細(xì)胞中surv

10、ivinmRNA和蛋白、VEGFmRNA表達(dá)下調(diào)，但p21和caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。 3、Survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示：survivin和VEGF在卵巢癌中均高表達(dá)。27例survivin陽性的卵巢癌病例中，19例VEGF呈陽性表達(dá)，二者共表達(dá)為50.00％。11例survivin陰性病例中8例VEGF呈陰性表達(dá)，同時(shí)不表達(dá)為21.05％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，surv

11、ivin和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：卵巢癌組織中survivin和VEGFmRNA的表達(dá)較正常卵巢明顯增高(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、Apigenin可以使卵巢癌細(xì)胞系CAOV3阻滯在細(xì)胞周期的G2/M期，并能誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮其抑制CAOV3細(xì)胞增殖的作用，這種增殖抑制作用具有量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。 2、Apigenin可以下調(diào)CAOV3細(xì)胞中survivin的表達(dá)，上調(diào)

12、p21和caspase-3的表達(dá)，推測apigenin抑制CAOV3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能與survivin表達(dá)下調(diào)繼而引起的癌細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡相關(guān)。Apigenin除可以抑制CAOV3細(xì)胞增殖外，還可以下調(diào)CAOV3細(xì)胞中VEGFmRNA的表達(dá)，具有潛在的抗腫瘤血管生成的作用。提示其有望成為一種新的抗卵巢癌藥物。 3、人卵巢癌組織中survivin和VEGF的mRNA和蛋白均呈高表達(dá)，survivin與VEGF蛋白在卵巢