胰高血糖素樣肽-1對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、背景:
　　迄今為止，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制仍不甚明了，導(dǎo)致對(duì)其防治依然缺乏有效的手段。現(xiàn)有的研究提示，心肌細(xì)胞凋亡與糖尿病心肌病的發(fā)病有密切關(guān)系。
　　我們猜想，胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)可以抑制晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPPs)引起的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。
　　

2、目的:
　　本研究以大鼠H9C2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平研究AOPPs是否可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡及GLP-1對(duì)其是否有保護(hù)作用，進(jìn)一步明確GLP-1是否通過(guò)下調(diào)RAGE表達(dá)進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激以及通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路拮抗AOPPs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，從而為糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制和防治策略提供新的理論依據(jù)和思維視角。
　　內(nèi)容:
　　本研究分以下兩部分:
　　第一章 晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)H9C2心肌

3、細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:
　　本部分實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察AOPPs對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡有何影響。
　　方法:
　　1.AOPPs的制備與鑒定
　　將大鼠血清白蛋白(rat serum albumin，RSA)與次氯酸溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中，室溫、避光放置30min，制備出AOPPs。AOPPs含量以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)通

4、過(guò)測(cè)定酸性條件下340nm的光吸收確定。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　復(fù)蘇大鼠H9C2心肌細(xì)胞后，用含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。2-3天換液或傳代一次。
　　3.cck-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力
　　不同濃度的AOPPs(200、400、800、1000ng/ml)作用大鼠H9C2細(xì)胞24h;1μg/ml AOPPs作用大鼠H9C2細(xì)胞不同時(shí)間(24、48、72h)。
　　將H

5、9C2細(xì)胞接種于96孔板，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)結(jié)束后向每孔加入10μlcck-8溶液，37℃孵育2h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)處的吸光度以判斷細(xì)胞增殖活性。
　　4.Hoechst33258法觀察細(xì)胞凋亡
　　經(jīng)cck-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)得出AOPPs的最佳作用濃度為1μg/ml，最佳作用時(shí)間為24h，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此濃度。
　　將H9C2細(xì)胞接種于6孔板，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、1

6、μg/ml AOPPsc處理組），干預(yù)后吸盡培養(yǎng)液，將細(xì)胞固定十分鐘，PBS清洗兩遍后加入Hoechst33258染色液染色5分鐘。PBS清洗后用抗熒光淬滅封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(激發(fā)波長(zhǎng)350nm)。
　　5.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　將H9C2細(xì)胞按分組（分組同上）干預(yù)后消化、收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷的PBS清洗兩次。用400μl1 X Binding Buffe

7、r懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入AnnexinⅤ-FITC（5μl/樣本），搖晃混勻后2-8℃避光條件孵育15分鐘。加入10μlPI混勻后2-8℃避光孵育5分鐘。1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀采用FL1和FL3雙通道波長(zhǎng)檢測(cè)。AnnexinⅤ-FITC發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，PI發(fā)射波長(zhǎng)為630nm。
　　6.Westem blot法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及Active-caspase-3蛋白的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)分組同上，

8、收集各組細(xì)胞后提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2h。洗膜后加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3及Active-caspase-3多克隆抗體常溫孵育2h，內(nèi)參抗體GAPDH1∶1500稀釋，反應(yīng)1h。洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，常溫振蕩孵育1h，洗膜。在暗室內(nèi)用ECL發(fā)光液1ml孵育膜5分鐘，曝光、顯影、沖片、定影、晾干保存。圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件Quantit

9、y One進(jìn)行灰度分析。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。多樣本比較方差齊時(shí)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);方差不齊時(shí)用校正Welch檢驗(yàn)，組間兩兩比較用Dunnett T3法。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　AOPPs能以劑量及時(shí)間依賴性的

10、方式誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞增殖活性下降，并且引起H9C2細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，凋亡執(zhí)行子caspase-3激活增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多。
　　第二章 胰高血糖素樣肽-1對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用的機(jī)制
　　目的:
　　上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)AOPPs可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡，本部分實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用以及該保護(hù)作

11、用的具體機(jī)制，為防治糖尿病心肌病提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.cck-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力
　　經(jīng)第一部分實(shí)驗(yàn)得出AOPPs干預(yù)H9C2細(xì)胞的最佳濃度及時(shí)間分別為1μg/ml及24h，因此，本實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為:空白對(duì)照組;1μg/mlAOPPs單獨(dú)處理組;50nM GLP-1單獨(dú)處理組;含1μg/mlAOPPs及10nM、50nM、100nM GLP-1的聯(lián)合處理組。具體方法同第一章。
　　2.Ho

12、echst33258法觀察細(xì)胞凋亡
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組;陰性對(duì)照組;1μg/ml AOPPs單獨(dú)處理組;50nMGLP-1單獨(dú)處理組;1μg/ml AOPPs及50nM GLP-1聯(lián)合處理組;1μg/ml AOPPs、50nM GLP-1及10μMLY294002聯(lián)合處理組。具體方法同第一章。
　　3.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　實(shí)驗(yàn)分組同上，具體方法同第一章。
　　4.細(xì)胞免

13、疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RAGE、GLP-1R的表達(dá)
　　在六孔板中加入消毒好的蓋玻片，加入細(xì)胞懸液制成細(xì)胞爬片。各孔同步化處理后按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞24h。固定、漂洗、穿孔、封閉后，加入1％BSA稀釋的一抗，4℃搖床過(guò)夜，漂洗。加入1％BSA稀釋的相應(yīng)二抗，于37℃雜交1h，漂洗。5μg/ml DAPI染色2mim，抗淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞RAGE、GLP-1R mRN

14、A水平
　　細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組處理后，Trizol法提取總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度，隨后按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行基因組去除反應(yīng)及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng):將配好的反應(yīng)液加入PCR擴(kuò)增板，蓋好密封膜，使用ABI熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃2min;95℃5秒，共40個(gè)循環(huán);60℃30秒，共40循環(huán)。采用相對(duì)定量法——CT值的定量方法計(jì)算各組樣本的相對(duì)表達(dá)量。
　　6.DCFH-DA熒光探針檢測(cè)

15、細(xì)胞內(nèi)活性氧
　　H9C2細(xì)胞培養(yǎng)在六孔板中，同步化處理后按各組處理因素（空白對(duì)照組、RSA陰性對(duì)照組、1μg/ml AOPPs單獨(dú)處理組、50nM GLP-1單獨(dú)處理組、1μg/mlAOPPs及50nM GLP-1聯(lián)合處理組）干預(yù)細(xì)胞2h。各組中分別加入終濃度為10μM的DCFH-DA，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)避光孵育30min。洗滌細(xì)胞三次后在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。隨后用胰酶消化、收集細(xì)胞，上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本計(jì)

16、數(shù)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，以CellQuest軟件分析活性氧陽(yáng)性的細(xì)胞占總細(xì)胞百分比。
　　7.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞RAGE、GLP-1R、p-Akt、Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax及active-caspase3蛋白的表達(dá)水平
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　檢測(cè)RAGE及GLP-1R蛋白的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)分為5組:空白對(duì)照組;陰性對(duì)照組;1μg/ml AOPPs處理組;50nM GLP-1處理組;1μg/ml AOPPs

17、及50nMGLP-1聯(lián)合處理組。
　　檢測(cè)細(xì)胞p-Akt、Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax及active-caspase3蛋白的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對(duì)照組;陰性對(duì)照組;1μg/ml AOPPs處理組;50nM GLP-1處理組;1μg/ml AOPPs及50nM GLP-1聯(lián)合處理組;1μg/ml AOPPs、50nM GLP-1及10μMLY294002聯(lián)合處理組。
　　方法同第一章。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理