表達(dá)人血清白蛋白-C肽融合蛋白畢赤酵母工程菌的構(gòu)建.pdf

1、C肽(C-Peptide,CP)是胰島素A鏈與B鏈之間的連接肽，近年來研究發(fā)現(xiàn)CP通過與細(xì)胞膜上G蛋白耦聯(lián)的受體結(jié)合，使Ca2+通道開放，激活Na+-K+-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性，增加血流量，擴(kuò)張血管，從而改善糖尿病患者的腎臟、神經(jīng)、微血管病變。為了加快CP的藥物化進(jìn)展，提高CP在體內(nèi)的半衰期，我們構(gòu)建了人血清白蛋白(HSA)-CP融合蛋白，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了鑒定、活性分析和初步的分離純化。

2、 根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性優(yōu)化CP基因，PCR從T-CP質(zhì)粒中擴(kuò)增CP基因，酶切連接pBlue-HSA質(zhì)粒(HSA1800bp)和CP(100bp)基因，構(gòu)建pBlue-HSA-CP質(zhì)粒。測序結(jié)果顯示得到的融合基因HSA-CP序列與預(yù)期一致。用EcoRI和NotI雙酶切重組質(zhì)粒pBlue-HSA-CP，回收HSA-CP片段，插入分泌表達(dá)載體。pPIC9k中，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-HSA-CP。表達(dá)載體pPIC9k-HSA-

3、CP經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析和PCR驗證表明，融合基因已經(jīng)成功的插入到載體pPIC9k中。 表達(dá)載體pPIC9k-HSA-CP經(jīng)SalI線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，用MM和MD平板篩選Mut+轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定后，用甲醇誘導(dǎo)搖瓶分泌表達(dá)。將表達(dá)量較高的重組子進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定和活性分析，優(yōu)化誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度后，對融合蛋白進(jìn)行初步的分離純化。經(jīng)G418篩選得到能耐受3mg/mLG418重組菌8株，進(jìn)一步搖瓶誘導(dǎo)篩選得到兩株表達(dá)