microRNA-146a和microRNA-155在吸入性肺損傷中的功能研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì)，吸入性肺損傷可使燒傷病人的整體死亡率增加20％以上。雖然隨著科學(xué)的發(fā)展，燒傷的整體救治水平有了很大的進(jìn)步，但對(duì)吸入性肺損傷而言，目前國(guó)內(nèi)外臨床救治仍停留在被動(dòng)的對(duì)癥治療水平，如開(kāi)放氣道（氣管切開(kāi)），吸氧，機(jī)械通氣等;國(guó)內(nèi)外對(duì)吸入性肺損傷發(fā)展的實(shí)驗(yàn)研究主要有以下兩方面:1、藥物治療機(jī)制;2、細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，尚缺乏主動(dòng)的特異性治療方法，表明我們至今對(duì)吸入性肺損傷的認(rèn)識(shí)還較為膚淺，究其原因是對(duì)其發(fā)病及病理變化機(jī)制還未真正闡明。因此，研究

2、吸入性肺損傷的確切發(fā)病機(jī)制及有效的干預(yù)措施實(shí)屬必要。
　　臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、大量自由基生成、促炎癥介質(zhì)在肺組織過(guò)度表達(dá)以及炎癥信號(hào)通路的激活是吸入肺損傷的早期重要的致病機(jī)制，Nuclear factorκB(NF-κB)信號(hào)通路是其中最為關(guān)鍵的一條，其通過(guò)多種途徑介導(dǎo)吸入性肺損傷的病理生理過(guò)程。因此，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化對(duì)于阻斷吸入肺損傷的致病機(jī)制、從而減輕其臨床癥狀、逆轉(zhuǎn)其病理生理過(guò)程具有積極的意義。

3、本實(shí)驗(yàn)組前期已證實(shí)NF-κ出信號(hào)通路中有多個(gè)微小RNA(microRNAs，miRNAs)啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用miRNAs靶點(diǎn)定向調(diào)控炎癥因子為臨床治療吸入性肺損傷開(kāi)辟了新途徑。
　　MiRNAs是RNA家族成員之一，真核細(xì)胞中一類由內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約18-25個(gè)核苷酸，參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。miRNA來(lái)源于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miRNA），在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Drosha)進(jìn)行第一步剪切后，形

4、成長(zhǎng)度約60-80個(gè)堿基的含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)。然后通過(guò)依賴Exportin-5的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨后在另一類核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Dicer)的第二次剪切作用下，加工形成約為18-25個(gè)堿基長(zhǎng)度的成熟miRNA。miRNA與靶mRNA3'-非翻譯區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后降解，或者與之部分結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡、胚胎發(fā)育、病毒感染、腫瘤發(fā)

5、生以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞接收外源或內(nèi)源壓力信號(hào)后的一種早期反應(yīng)表現(xiàn)為miRNAs的表達(dá)，參與調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答。但目前關(guān)于miRNAs在吸入性肺損傷的作用還鮮有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在H．pylori感染胃上皮細(xì)胞模型中表明了miR-146a和miR-155基因的啟動(dòng)子序列中含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)了炎癥感染誘導(dǎo)miR-146a和miR-155的高表達(dá)受到NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)。因此，我們根據(jù)前期實(shí)

6、驗(yàn)，在吸入性肺損傷模型中，尋找miR-146a和miR-155新的靶基因，并驗(yàn)證其在吸入性肺損傷中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　MiR-146a、miR-155在煙霧刺激吸入性肺損傷中的功能研究。
　　1、靶基因的預(yù)測(cè):根據(jù)生物信息學(xué)TargetScan、Miranda、PicTar三大靶標(biāo)分析軟件預(yù)測(cè)miR-146a、miR-155靶基因，通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合靶基因功能篩選與NF-κB炎性關(guān)系更貼近的基因。
　　

7、2、熒光素酶實(shí)驗(yàn):鑒定miR-146a、miR-155分別與靶基因結(jié)合作用。
　　3、Real-time PCR實(shí)驗(yàn):
　　細(xì)胞模型:
　?、贆z測(cè)轉(zhuǎn)染miR-146a、miR-155在A549細(xì)胞中靶基因的RNA的表達(dá)
　?、跈z測(cè)煙霧顆粒刺激轉(zhuǎn)染miR-146a、miR-155 A549細(xì)胞中靶基因及炎癥因子RNA的表達(dá)。
　　動(dòng)物模型:
　　檢測(cè)煙霧刺激小鼠轉(zhuǎn)染miR-146a、miR-155肺組織

8、中靶基因及炎癥因子RNA的表達(dá)。
　　4、Western blot實(shí)驗(yàn):檢測(cè)細(xì)胞模型、動(dòng)物模型靶基因蛋白、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)。
　　5、ELISA實(shí)驗(yàn):檢測(cè)細(xì)胞模型、動(dòng)物模型炎癥因子白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）、生長(zhǎng)相關(guān)癌基因α(Growth-related oncogene-α，GRO-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic

9、 peptide-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達(dá)。
　　本研究結(jié)果表明:
　　1、miR-146a和miR-155靶基因的預(yù)測(cè)及鑒定。
　?、倮肨argetScan、Miranda、PicTar三大靶標(biāo)分析軟件預(yù)測(cè)到miR-146a的靶基因:Fas相關(guān)因子2(Fas associated f

10、actor2，F(xiàn)AF-2)、Notch2; miR-155的靶基因:髓樣分化因子88(myeloid differentiationfactor88，MyD88)。
　?、跇?gòu)建含有作用靶點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體，證實(shí)了miR-146a和miR-155能與靶基因的3'-UTR結(jié)合;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，miR-146a可通過(guò)降解FAF-2、Notch-2的mRNA的表達(dá)，miR-155可抑制MyD88的mRNA表達(dá)。
　　2、m

11、iR-146a和miR-155在吸入性肺損傷中功能鑒定
　　通過(guò)細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)miR-146a、miR-155后，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot證實(shí)了miR-146a和miR-155能與靶基因的3'-UTR結(jié)合，能夠減少煙霧刺激吸入性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)關(guān)鍵酶COX-2和炎癥因子IL-8、GRO-α、MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達(dá)(P＜0.05)，證明miR-146a和miR-155在吸入性肺損傷炎癥

12、反應(yīng)中起到調(diào)控作用。
　　結(jié)論:
　　1、預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了miR-146a和miR-155在小鼠肺上皮細(xì)胞中的一小部分靶基因，表明miR-146a和miR-155通過(guò)作用于FAF-2、Notch-2、MyD88等在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵蛋白，參與調(diào)控吸入性肺損傷引起的炎癥反應(yīng)。
　　2、miR-146a和miR-155作為一類新的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，與其靶基因構(gòu)成全新的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，參與吸入性肺損傷中炎癥