microRNA-155靶向PICALM抑制腸道病毒71型在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制.pdf

1、目的：
　　腸道病毒71型(EV71)屬微小RNA病毒科腸道病毒屬A組,是引起手足口病的主要病原體之一。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子 RNA，miRNA不編碼蛋白,而是通過與mRNA的3'端非編碼區(qū)或編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，降解或者抑制mRNA的翻譯來抑制基因的表達(dá)。在EV71感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH）miRNA差異表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用miRNA（模擬體）mi

2、mic和 miRNA（抑制體）inhibitor篩選并驗(yàn)證了對(duì)EV71有調(diào)控作用的miRNA-155(miR-155)，并進(jìn)一步闡明了miR-155通過靶向PICALM抑制EV71在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制。
　　方法：
　?。?）收集感染EV71前后的SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞，提取總RNA，利用miRNA芯片得出EV71感染SK-N-SH前后差異miRNA表達(dá)譜，篩選EV71感染SK-N-SH前后顯著差異的miRNA；并利用實(shí)時(shí)熒光

3、定量RT-PCR(QRT-PCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　?。?）利用miRNA mimic和 miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞，改變miRNA水平，利用細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察、病毒滴度TCID50測(cè)定、QRT-PCR、Western blotting(WB)等方法,與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較EV71病毒復(fù)制的變化，驗(yàn)證miRNA對(duì)EV71在SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制的調(diào)控作用。
　　（3）利用mi

4、RNA的靶基因數(shù)據(jù)庫miRanda,TargetScan和miRbase，篩選miRNA的靶基因，雙熒光素報(bào)告酶法驗(yàn)證miRNA的靶基因。利用靶基因的過表達(dá)載體和小干擾RNA(si-RNA)分別上調(diào)和下調(diào)靶基因的表達(dá)后，觀察miRNA對(duì)EV71調(diào)控作用的變化，驗(yàn)證miRNA通過靶向基因調(diào)控EV71在神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制。
　　結(jié)果:
　?。?）在EV71感染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后，miRNA芯片和qRT-PCR結(jié)果均顯示miR

5、NA-155的表達(dá)水平顯著上升，且miR-155的上升與EV71病毒的感染量、感染時(shí)間均呈正相關(guān)。
　?。?）miRNA-155 mimic轉(zhuǎn)染SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞后，miR-155水平顯著上升，與陰性對(duì)照相比，EV71在SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞中的復(fù)制被抑制。同時(shí)，miR-155對(duì)EV71病毒復(fù)制的抑制作用與miR-155的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　?。?）利用miRBase等生物學(xué)軟件并結(jié)合基因功能，篩選出miR-155的候