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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述:
第一部分 冠心病患者microRNA-155與Th細(xì)胞分化的相關(guān)性
目的:觀察CHD患者外周血中炎癥相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況和Th細(xì)胞亞群的分化情況,并分析二者之間的關(guān)系。
方法:收集穩(wěn)定型心絞痛(stable angina, SA)患者、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina, UA)患者、AMI患者及性別、年齡與其無差異的胸痛綜合征(chest pain s
2、yndrome, CPS)患者各15-16例。分別采集每位患者外周血8mL,離心收集血漿,密度梯度法離心獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。用Trizol LS和Trizol試劑分別提取外周血血漿及PBMCs中的RNA,再用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription and quantitative real-time polymer
3、ase chain reaction, qRT-PCR)的方法檢測炎癥相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況;用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測患者外周血PBMCs中Th細(xì)胞亞群的比例;用熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization, FISH)及免疫組化的方法分別顯示PBMCs中miR-155和Th17細(xì)胞的分布情況。
結(jié)果:與CPS患者PBMCs中相應(yīng)miRNAs的表達(dá)水平相比,UA和AMI患者PBMCs中m
4、iR-21和miR-146a的表達(dá)水平均升高約2倍(p<0.01),miR-155的表達(dá)水平則降低約50%(p<0.01),而miR-125a-5p、miR-125b和miR-31的表達(dá)水平無明顯變化(p>0.05)。除了miR-21,上述其他miRNAs在UA及AMI患者血漿中的表達(dá)情況與它們在PBMCs中的表達(dá)情況基本一致(p>0.05)。但與CPS患者血漿中 miR-21的表達(dá)量相比,AMI患者血漿中其表達(dá)量升高約6倍(p<0.0
5、1),而UA患者血漿中其表達(dá)量無明顯變化(p>0.05)。然而,SA患者外周血中上述miRNAs的表達(dá)水平與CPS患者相比無明顯差異(p>0.05)。進(jìn)一步分析了CHD患者PBMCs中各個(gè)Th細(xì)胞亞群的比例。結(jié)果顯示,與CPS患者相比,UA和AMI患者PBMCs中Th1和Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例明顯升高(p<0.01),Treg細(xì)胞的比例明顯降低(p<0.01),而Th2細(xì)胞的比例則無明顯變化(p>0.05)。進(jìn)一步,用Sp
6、earman’s相關(guān)性分析法分析發(fā)現(xiàn),ACS患者(包括UA及AMI患者)PBMCs中miR-155的表達(dá)與Th17細(xì)胞的比例呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.896, p<0.01)。深入研究還發(fā)現(xiàn),miR-155和IL-17A可共表達(dá)于UA及AMI患者PBMCs中相同細(xì)胞內(nèi)。
結(jié)論:部分炎癥相關(guān)的miRNAs在ACS患者外周血中呈特異性表達(dá),且miR-155的表達(dá)水平與Th細(xì)胞的分化密切相關(guān)。
第二部分 MicroRNA-1
7、55誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化的作用機(jī)制
目的:明確miR-155如何調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群(包括Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞)的分化及其特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá),并明確miR-155主要作用的靶基因及其主要調(diào)節(jié)的信號通路。
方法:取BALB/c小鼠脾臟,研磨并密度梯度法離心獲取脾臟單個(gè)核細(xì)胞;磁珠分選獲得高純度CD4+T細(xì)胞(純度>95%);用nucleofection的方法將寡聚核苷酸(包括pre-m
8、iR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl、anti-miR-155、SOCS1-TPmiR-155和control-TPmiR-155)轉(zhuǎn)入CD4+T細(xì)胞;用特異性抗體活化并極化CD4+T細(xì)胞;用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞亞群的比例;用qRT-PCR的方法檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況;用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測相關(guān)細(xì)
9、胞因子的表達(dá)情況;用免疫印跡分析(Western boltting)檢測靶基因及相關(guān)信號通路中重要蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果:當(dāng)miR-155過表達(dá)時(shí),Th17及Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例及其標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子孤獨(dú)受體(retinoic acidrelated orphan receptorγt, ROR-γt)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Fork head/winged helix transcription facto
10、r, Foxp3)的表達(dá)明顯高于對照組(p<0.05)。反之,當(dāng)miR-155的表達(dá)被抑制時(shí),Th17及Treg細(xì)胞的比例及其標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)則明顯低于對照組(p<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)miR-155過表達(dá)時(shí),Th17細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子白介素-17A(interleukin17A, IL-17A)的表達(dá)也明顯升高(p<0.05),而miR-155被抑制后,其表達(dá)則明顯降低(p<0.05)。然而,miR-155對Treg的功能性細(xì)
11、胞因子IL-10及腫瘤生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表達(dá)無明顯調(diào)控作用(p>0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),酪氨酸蛋白激酶-信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinas/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路的負(fù)反饋抑制因子,即細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cyt
12、okine-signaling-1, SOCS1)是miR-155的重要靶基因。在CD4+T細(xì)胞分化過程中,miR-155通過抑制SOCS1的表達(dá)而間接激活JAK/STAT信號通路,進(jìn)而促進(jìn)Th17及Treg細(xì)胞的分化,并影響Th17的功能。研究還證實(shí),當(dāng)miR-155過表達(dá)時(shí),Th1的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和功能性細(xì)胞因子,即T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(T-box expressed in T cells, T-bet)和干擾素-γ(interferon
13、-γ, IFN-γ)的表達(dá)明顯高于對照組,而Th2的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和功能性細(xì)胞因子,即GATA結(jié)合蛋白(GATA-binding protein-3, GATA3)和IL-4的表達(dá)則明顯低于對照組(p<0.05);而當(dāng)miR-155被抑制后,Th1和Th2的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)與上述情況恰好相反(p<0.05)。
結(jié)論:MiR-155可促進(jìn)促炎性CD4+T細(xì)胞亞群Th1及Th17細(xì)胞的分化及其功能的發(fā)揮;抑制抑炎性C
14、D4+T細(xì)胞亞群Th2細(xì)胞的分化及其功能的發(fā)揮;而對Treg細(xì)胞,miR-155可促進(jìn)其分化,但并不影響其功能的發(fā)揮。而且miR-155主要通過抑制JAK/STAT信號通路的負(fù)反饋抑制因子SOCS1的表達(dá)而調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞的分化??傊?,miR-155可通過抑制SOCS1的表達(dá)而誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化的失衡。
第三部分 MicroRNA-155誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向DC細(xì)胞分化
目的:明確miR-155如
15、何調(diào)控RAW264.7細(xì)胞表面分子及細(xì)胞因子的表達(dá)。
方法:培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,用Attractene Transfection Reagent將寡聚核苷酸(包括pre-miR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl及anti-miR-155)轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞;用不同濃度的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density
16、lipoprotein, oxLDL)刺激細(xì)胞;用qRT-PCR的方法檢測miR-155的表達(dá)量;用流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)記物的表達(dá)量;用qRT-PCR及ELISA的方法檢測細(xì)胞因子的表達(dá)量。
結(jié)果:用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24hrs后,miR-155的表達(dá)量比對照組升高約200倍(p<0.01),而用oxLDL刺激細(xì)胞24hrs后,其表達(dá)量僅升高約2倍(p<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在LPS或oxLDL活化的RAW2
17、64.7細(xì)胞中過表達(dá)miR-155后,其表面分子人類主要組織相容性復(fù)合體-I(Major histocompatibility complex-I, MHC-I)、MHC-II、CD86及CD83及細(xì)胞因子IL-6、IL-12及IL-1b的表達(dá)均升高(p<0.05),相反,當(dāng)miR-155的表達(dá)被抑制時(shí),上述表面分子和細(xì)胞因子的表達(dá)則降低(p<0.05)。此外,在oxLDL活化的RAW264.7細(xì)胞中,miR-155誘導(dǎo)表達(dá)的表面分子還
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