含有cry8E基因綠僵菌工程菌的構(gòu)建及致病機(jī)制初步分析.pdf

1、在花生的種植過程中，以蠐螬為主的地下害蟲危害最為嚴(yán)重。長期以來地下害蟲的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境，且防治成本高，害蟲易產(chǎn)生抗藥性，尤其是農(nóng)藥與花生果莢接觸，增加了花生中農(nóng)藥的含量，直接危害人體健康。因此，使用生物防治方法防治蠐螬已經(jīng)成為當(dāng)前的主要趨勢。綠僵菌（Metarhizium）作為重要的昆蟲病原真菌，越來越受到人們的重視，它具有靶標(biāo)性強(qiáng)、持效期長、不易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，是重要的生防真菌。但在實(shí)際的應(yīng)用中

2、微生物制劑暴露出菌種毒力低、致死時(shí)間長等缺點(diǎn)。因此，通過基因工程方法構(gòu)建能夠穩(wěn)定遺傳的，高效殺蟲綠僵菌菌株成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢，并且是順應(yīng)當(dāng)今農(nóng)業(yè)綠色植保、循環(huán)治理主題下的必然選擇。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　⑴構(gòu)建了以來源于蘇云金芽孢桿菌、對地下害蟲暗黑鰓金龜幼蟲高效的殺蟲晶體蛋白基因cry8E為目的基因，以苯菌靈benA3為抗性標(biāo)記基因的真菌表達(dá)載體pCAMBIA1300-ben-8e，采用電擊轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌（Ag

3、robactrium tumefaciens）菌株EHA105和LBA4404中，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將cry8E基因插入到綠僵菌基因組中。通過PCR檢測獲得陽性轉(zhuǎn)化子，用Southern雜交進(jìn)一步證實(shí)了cry8E基因以單拷貝形式插入綠僵菌的基因組。
　?、撇捎冒柰练y定了部分轉(zhuǎn)化子對2齡暗黑鰓金龜幼蟲的毒力。結(jié)果顯示，與野生型M202菌株相比，不同轉(zhuǎn)化子間毒力差異較大，LT50的變化范圍為14.48～21.26天，校正累計(jì)

4、死亡率變化范圍為64.50％～92.86％。轉(zhuǎn)化子M202-31的毒力較強(qiáng)，校正累積死亡率和LT50值分別為92.857％和14.925d，與其它菌株存在顯著性差異。
　?、菧y定了6株陽性轉(zhuǎn)化子的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和磷脂酶活性，并分析了各個(gè)酶活指標(biāo)與菌株毒力之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，各個(gè)酶活、不同菌株之間差異較大，且變化規(guī)律不一致，在酸性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和磷脂酶活性測定中，轉(zhuǎn)化子M202-31分別與野生型菌

5、株相比，具有顯著性差異。將不同轉(zhuǎn)化子的酶活分別與校正累積死亡率和LT50值進(jìn)行一元回歸分析，發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)化菌株酸性蛋白酶和幾丁質(zhì)酶與毒力相關(guān)顯著。為了進(jìn)一步確定酸性蛋白酶和幾丁質(zhì)酶對毒力的綜合影響，將不同轉(zhuǎn)化子的酶活與校正累積死亡率、LT50進(jìn)行二元回歸分析，發(fā)現(xiàn)僅有幾丁質(zhì)酶活性與菌株毒力相關(guān)性顯著。因此，推測不同轉(zhuǎn)化子對寄主毒力存在差異主要是由于菌株間幾丁質(zhì)酶活性不同，幾丁質(zhì)酶可以作為轉(zhuǎn)化子初步篩選的參考性指標(biāo)。
　?、仍囼?yàn)中以3齡

6、東亞飛蝗蝗蝻為供試蟲源，測定了野生型M202菌株、Bt185菌株、Bt185菌株和M202菌株混合、2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子、空白對照6個(gè)處理的毒力。結(jié)果表明，將Bt185與M202混合后，顯著增加了野生型菌株M202的毒力;同時(shí)，插入cry8E基因后顯著提高了野生型菌株的毒力，其校正累計(jì)死亡率提高38.6542％，致死中時(shí)縮短2.9180d。
　?、蓽y定了處理CK、M202、轉(zhuǎn)化子M202-12和M202-31連續(xù)5天對東亞飛蝗體內(nèi)EST