含有cry8E基因綠僵菌工程菌的構建及致病機制初步分析.pdf

1、在花生的種植過程中，以蠐螬為主的地下害蟲危害最為嚴重。長期以來地下害蟲的防治主要采用化學農藥，但化學農藥污染環(huán)境，且防治成本高，害蟲易產生抗藥性，尤其是農藥與花生果莢接觸，增加了花生中農藥的含量，直接危害人體健康。因此，使用生物防治方法防治蠐螬已經成為當前的主要趨勢。綠僵菌（Metarhizium）作為重要的昆蟲病原真菌，越來越受到人們的重視，它具有靶標性強、持效期長、不易產生抗藥性、對環(huán)境安全等優(yōu)點，是重要的生防真菌。但在實際的應用中

2、微生物制劑暴露出菌種毒力低、致死時間長等缺點。因此，通過基因工程方法構建能夠穩(wěn)定遺傳的，高效殺蟲綠僵菌菌株成為當前的發(fā)展趨勢，并且是順應當今農業(yè)綠色植保、循環(huán)治理主題下的必然選擇。本研究取得的主要結果如下：
　?、艠嫿艘詠碓从谔K云金芽孢桿菌、對地下害蟲暗黑鰓金龜幼蟲高效的殺蟲晶體蛋白基因cry8E為目的基因，以苯菌靈benA3為抗性標記基因的真菌表達載體pCAMBIA1300-ben-8e，采用電擊轉化法將其導入根癌農桿菌（Ag

3、robactrium tumefaciens）菌株EHA105和LBA4404中，通過根癌農桿菌介導轉化法，將cry8E基因插入到綠僵菌基因組中。通過PCR檢測獲得陽性轉化子，用Southern雜交進一步證實了cry8E基因以單拷貝形式插入綠僵菌的基因組。
　?、撇捎冒柰练y定了部分轉化子對2齡暗黑鰓金龜幼蟲的毒力。結果顯示，與野生型M202菌株相比，不同轉化子間毒力差異較大，LT50的變化范圍為14.48～21.26天，校正累計

4、死亡率變化范圍為64.50％～92.86％。轉化子M202-31的毒力較強，校正累積死亡率和LT50值分別為92.857％和14.925d，與其它菌株存在顯著性差異。
　?、菧y定了6株陽性轉化子的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、幾丁質酶和磷脂酶活性，并分析了各個酶活指標與菌株毒力之間的相關性。結果表明，各個酶活、不同菌株之間差異較大，且變化規(guī)律不一致，在酸性蛋白酶、幾丁質酶和磷脂酶活性測定中，轉化子M202-31分別與野生型菌

5、株相比，具有顯著性差異。將不同轉化子的酶活分別與校正累積死亡率和LT50值進行一元回歸分析，發(fā)現(xiàn)各轉化菌株酸性蛋白酶和幾丁質酶與毒力相關顯著。為了進一步確定酸性蛋白酶和幾丁質酶對毒力的綜合影響，將不同轉化子的酶活與校正累積死亡率、LT50進行二元回歸分析，發(fā)現(xiàn)僅有幾丁質酶活性與菌株毒力相關性顯著。因此，推測不同轉化子對寄主毒力存在差異主要是由于菌株間幾丁質酶活性不同，幾丁質酶可以作為轉化子初步篩選的參考性指標。
　?、仍囼炛幸?齡

6、東亞飛蝗蝗蝻為供試蟲源，測定了野生型M202菌株、Bt185菌株、Bt185菌株和M202菌株混合、2個陽性轉化子、空白對照6個處理的毒力。結果表明，將Bt185與M202混合后，顯著增加了野生型菌株M202的毒力;同時，插入cry8E基因后顯著提高了野生型菌株的毒力，其校正累計死亡率提高38.6542％，致死中時縮短2.9180d。
　　⑸測定了處理CK、M202、轉化子M202-12和M202-31連續(xù)5天對東亞飛蝗體內EST