疑難降解檢材DNA檢驗(yàn)方法研究.pdf

1、目的：本論文以陳舊骨骼、牙齒及福爾馬林固定石蠟包埋組織中殘留的少量降解的核酸分子作為研究對(duì)象，利用多種技術(shù)方法，比較并建立適合降解檢材的提取技術(shù)方法。并將建立的方法應(yīng)用于其他案件中常見(jiàn)微量降解的檢材；對(duì)骨骼、牙齒、福爾馬林固定石蠟包埋組織及其他疑難降解檢材中沒(méi)有得到完整STR分型的，應(yīng)用MiniFilerTM試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，并評(píng)估MiniFilerTM試劑盒在疑難降解檢材STR分型中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。 方法：選取10例已知檢驗(yàn)結(jié)

2、果的骨骼和牙齒樣本，分別用不同脫鈣、不同裂解液、不同純化的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并比較；在此基礎(chǔ)上改進(jìn)并建立骨骼提取的方法；并應(yīng)用建立的方法對(duì)24例案件中骨胳樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。 選取10例醫(yī)院病理科收集的福爾馬林固定石蠟包埋組織，經(jīng)不同的脫蠟溫度和脫蠟時(shí)間預(yù)處理后提取石蠟包埋人體組織中的DNA進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，比較不同預(yù)處理方法對(duì)DNA提取效果的影響；選取經(jīng)上述預(yù)處理后效果最優(yōu)的一組分別采用有機(jī)法和Chelex-100法進(jìn)行提取，比較兩種方法

3、的提取效果；將10例石蠟包埋組織得到的分型結(jié)果與相應(yīng)的血樣DNA進(jìn)行比對(duì)，觀察癌組織基因突變對(duì)PCR反應(yīng)及結(jié)果分析的影響。 對(duì)13例其他疑難降解檢材，包括現(xiàn)場(chǎng)血跡、毛發(fā)、口香糖、煙蒂等采用MiniFilerTM與IdentiFilerTM試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，并對(duì)兩種試劑盒的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較。 結(jié)果：用于比較研究的10例骨骼和牙齒樣本經(jīng)過(guò)預(yù)脫鈣后的檢驗(yàn)結(jié)果明顯優(yōu)于未脫鈣的結(jié)果；OEB與異硫腈胍裂解液(GuSCN裂解液)消化的

4、能力無(wú)顯著性差異；使用QIA quick Spin Column純化柱的檢驗(yàn)較Microncon100有明顯優(yōu)勢(shì)。建立了OEB混合液裂解聯(lián)合QIA quick Spin Column純化骨骼樣本的方法。案件應(yīng)用中的24例骨骼和牙齒樣本，其中23例的檢驗(yàn)均得到12個(gè)以上STR基因座的結(jié)果，仍有一例無(wú)STR分型結(jié)果。10例福爾馬林固定石蠟包埋組織，室溫中時(shí)間分別為2、12小時(shí)2次脫蠟與37℃一次脫蠟10min組得到的分型圖譜沒(méi)有明顯差異，而

5、37℃分2次脫蠟，時(shí)間分別為2、12小時(shí)組得到的分型圖譜峰高值均好于前兩組，脫蠟均較徹底。10例樣本經(jīng)有機(jī)法提取QIA quick純化柱純化組，有9例均得到完整STR分型結(jié)果，僅有1例得到部分基因座的分型結(jié)果：而經(jīng)Chelex-100法提取組無(wú)1例得到STR分型結(jié)果。癌組織的基因突變會(huì)使STR分型結(jié)果發(fā)生改變，本文10例癌組織石蠟切片發(fā)現(xiàn)存在嵌合、等位基因丟失、峰高不均衡等現(xiàn)象。采用MiniFilerTM與IdentiFilerTM試劑

6、盒對(duì)13例其他疑難降解檢材檢驗(yàn)的結(jié)果顯示：13例其他疑難降解檢材采用IdentiFilerTM試劑盒的檢驗(yàn)，在未定量的情況下經(jīng)過(guò)1μl、2μl、4μl梯度擴(kuò)增，13例無(wú)1例獲得完整分型，片段長(zhǎng)度在200-370bp范圍內(nèi)的基因座均有不同程度的等位基因缺失；而采用MiniFilerTM試劑盒補(bǔ)充檢驗(yàn)均獲得完整分型。采用對(duì)照樣本DNA9947對(duì)MiniFilerTM試劑盒和IdentiFilerTM試劑盒靈敏度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MiniFilerT

7、M試劑盒可以達(dá)到0.01ng，而IdentiFilerTM試劑盒可以達(dá)到0.08ng。 結(jié)論：本文建立的OEB混合液裂解聯(lián)合QIA quick Spin Column純化骨骼樣本的方法穩(wěn)定高效，可用于陳舊骨骼及牙齒樣本的DNA檢驗(yàn)：在福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA的提取過(guò)程中，適當(dāng)?shù)脑黾訙囟取⒀娱L(zhǎng)脫蠟時(shí)間、有機(jī)法提取聯(lián)合QIA quick純化柱純化的方法均可以提高DNA的檢驗(yàn)成功率；在其他疑難降解檢材的研究中，MiniFiler