疑難降解檢材DNA檢驗方法研究.pdf

1、目的：本論文以陳舊骨骼、牙齒及福爾馬林固定石蠟包埋組織中殘留的少量降解的核酸分子作為研究對象，利用多種技術(shù)方法，比較并建立適合降解檢材的提取技術(shù)方法。并將建立的方法應(yīng)用于其他案件中常見微量降解的檢材；對骨骼、牙齒、福爾馬林固定石蠟包埋組織及其他疑難降解檢材中沒有得到完整STR分型的，應(yīng)用MiniFilerTM試劑盒進行檢驗，并評估MiniFilerTM試劑盒在疑難降解檢材STR分型中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。 方法：選取10例已知檢驗結(jié)

2、果的骨骼和牙齒樣本，分別用不同脫鈣、不同裂解液、不同純化的方法進行實驗并比較；在此基礎(chǔ)上改進并建立骨骼提取的方法；并應(yīng)用建立的方法對24例案件中骨胳樣本進行檢驗。 選取10例醫(yī)院病理科收集的福爾馬林固定石蠟包埋組織，經(jīng)不同的脫蠟溫度和脫蠟時間預(yù)處理后提取石蠟包埋人體組織中的DNA進行復(fù)合擴增檢驗，比較不同預(yù)處理方法對DNA提取效果的影響；選取經(jīng)上述預(yù)處理后效果最優(yōu)的一組分別采用有機法和Chelex-100法進行提取，比較兩種方法

3、的提取效果；將10例石蠟包埋組織得到的分型結(jié)果與相應(yīng)的血樣DNA進行比對，觀察癌組織基因突變對PCR反應(yīng)及結(jié)果分析的影響。 對13例其他疑難降解檢材，包括現(xiàn)場血跡、毛發(fā)、口香糖、煙蒂等采用MiniFilerTM與IdentiFilerTM試劑盒進行檢驗，并對兩種試劑盒的檢測靈敏度進行比較。 結(jié)果：用于比較研究的10例骨骼和牙齒樣本經(jīng)過預(yù)脫鈣后的檢驗結(jié)果明顯優(yōu)于未脫鈣的結(jié)果；OEB與異硫腈胍裂解液(GuSCN裂解液)消化的

4、能力無顯著性差異；使用QIA quick Spin Column純化柱的檢驗較Microncon100有明顯優(yōu)勢。建立了OEB混合液裂解聯(lián)合QIA quick Spin Column純化骨骼樣本的方法。案件應(yīng)用中的24例骨骼和牙齒樣本，其中23例的檢驗均得到12個以上STR基因座的結(jié)果，仍有一例無STR分型結(jié)果。10例福爾馬林固定石蠟包埋組織，室溫中時間分別為2、12小時2次脫蠟與37℃一次脫蠟10min組得到的分型圖譜沒有明顯差異，而

5、37℃分2次脫蠟，時間分別為2、12小時組得到的分型圖譜峰高值均好于前兩組，脫蠟均較徹底。10例樣本經(jīng)有機法提取QIA quick純化柱純化組，有9例均得到完整STR分型結(jié)果，僅有1例得到部分基因座的分型結(jié)果：而經(jīng)Chelex-100法提取組無1例得到STR分型結(jié)果。癌組織的基因突變會使STR分型結(jié)果發(fā)生改變，本文10例癌組織石蠟切片發(fā)現(xiàn)存在嵌合、等位基因丟失、峰高不均衡等現(xiàn)象。采用MiniFilerTM與IdentiFilerTM試劑

6、盒對13例其他疑難降解檢材檢驗的結(jié)果顯示：13例其他疑難降解檢材采用IdentiFilerTM試劑盒的檢驗，在未定量的情況下經(jīng)過1μl、2μl、4μl梯度擴增，13例無1例獲得完整分型，片段長度在200-370bp范圍內(nèi)的基因座均有不同程度的等位基因缺失；而采用MiniFilerTM試劑盒補充檢驗均獲得完整分型。采用對照樣本DNA9947對MiniFilerTM試劑盒和IdentiFilerTM試劑盒靈敏度檢測發(fā)現(xiàn)，MiniFilerT

7、M試劑盒可以達到0.01ng，而IdentiFilerTM試劑盒可以達到0.08ng。 結(jié)論：本文建立的OEB混合液裂解聯(lián)合QIA quick Spin Column純化骨骼樣本的方法穩(wěn)定高效，可用于陳舊骨骼及牙齒樣本的DNA檢驗：在福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA的提取過程中，適當(dāng)?shù)脑黾訙囟?、延長脫蠟時間、有機法提取聯(lián)合QIA quick純化柱純化的方法均可以提高DNA的檢驗成功率；在其他疑難降解檢材的研究中，MiniFiler