法醫(yī)學(xué)降解檢材DNA分析的新指標(biāo)探索.pdf

1、目的：為了提高分析DNA高度降解樣本的成功率，探索一些針對高度降解DNA分析的新方法、新指標(biāo)十分必要。本課題旨在構(gòu)建一些有利于分析高度降解DNA的方法，以彌補(bǔ)商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒在分析高度降解DNA的不足，增加法醫(yī)學(xué)個(gè)人識別能力。 方法：從法醫(yī)檢案的實(shí)踐中挑選出商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒DNA分析成功率最低的4個(gè)STR基因座，通過修改引物結(jié)合區(qū)的位置，減小擴(kuò)增片段的長度，將其構(gòu)建一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增熒光檢測和自動化分型體系(min

2、iSTR)。將miniSTR與商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的分型結(jié)果進(jìn)行一致性、抗降解和抗PCR抑制物能力比對實(shí)驗(yàn)，依據(jù)DNA分析技術(shù)工作組(TWGDAM)指南進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性研究。 選擇5個(gè)單核苷酸多態(tài)性基因座(SNP)作為研究對象，3個(gè)(rs999842、rs922992、rs924181)定位于常染色體，一個(gè)(rs997262)定位于X染色體，一個(gè)(m9)位于Y染色體。將其構(gòu)建成一個(gè)超短片段長度PCR復(fù)合擴(kuò)增體系，利用多重單

3、堿基延伸熒光檢測方法進(jìn)行分型，與構(gòu)建的miniSTR進(jìn)行抗降解和抗PCR抑制劑能力對比實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性、群體遺傳學(xué)和性別判斷的研究。 構(gòu)建一個(gè)PCR內(nèi)對照物，使其能與商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒一同擴(kuò)增，一同電泳，一同自動化分型。通過觀察內(nèi)對照產(chǎn)物峰高情況，確定PCR反應(yīng)中抑制物的存在和作用情況。結(jié)合案例進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性評估。 結(jié)果：通過統(tǒng)計(jì)220份法醫(yī)生物物證樣本的DNA分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒對

4、D7S820、D18S51、CSF1P0、D2S1338、FGA五個(gè)基因座分型的成功率最低。由于FGA的核心重復(fù)基序的序列太長，無法將其擴(kuò)增片段長度減小到理想的程度，不適合進(jìn)行小片段STR設(shè)計(jì)。于是我們建立了一個(gè)含有D7S820、D18S51、CSF1P0和D2S1338共4個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增熒光檢測體系(miniSTR)。通過比對商業(yè)試劑盒Identifiler這4個(gè)基因座的分型結(jié)果、分析高度降解DNA的能力和抵抗PCR抑制物的作用，

5、發(fā)現(xiàn)miniSTR分型結(jié)果與商業(yè)試劑盒Identifiler的結(jié)果相同；miniSTR比商業(yè)試劑盒更能從高度降解DNA中得到STR基因座分型結(jié)果，在PCR反應(yīng)時(shí)，能從更高濃度的抑制物(血紅蛋白)中得到分型結(jié)果。法醫(yī)可行性研究結(jié)果顯示，該復(fù)合擴(kuò)增體系的靈敏度達(dá)到200pg，分型結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，能夠?qū)ΤＲ娀|(zhì)上的斑痕正確分型，具有較好的組織同一性和種屬特異性。用于實(shí)際檢案，可以提高DNA高度降解檢材分型成功率。 構(gòu)建的5個(gè)SNP

6、復(fù)合擴(kuò)增體系，片段長度在60-70bp之間。應(yīng)用多重引物單堿基延伸熒光檢測技術(shù)進(jìn)行分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP比miniSTR從高度降解DNA中得到分型結(jié)果的成功率更高，并且能從含更高濃度抑制物(血紅蛋白)的樣本中得到分型。法醫(yī)可行性研究顯示，檢驗(yàn)的最低模板量為100pg，分型結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，對法醫(yī)常見生物檢材，包括毛發(fā)、血痕、精斑、煙蒂等均獲得正確結(jié)果，并且可以判斷檢材來源者的性別。通過分別對20名無關(guān)男性個(gè)體和20名無關(guān)女性個(gè)體分型，得

7、出5個(gè)SNP的等位基因頻率分布資料。所有常染色體SNP的雜合度均大于0.43，顯示出良好的多態(tài)性。 構(gòu)建的PCR內(nèi)對照物，所產(chǎn)生的片段大小為83bp，與商品化STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒內(nèi)標(biāo)為同種熒光染料標(biāo)記，能與商業(yè)試劑盒一同擴(kuò)增、電泳分離及熒光檢測，不影響商業(yè)試劑盒分型結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏度和種屬特性等特征?？梢酝ㄟ^觀察內(nèi)對照產(chǎn)物峰高情況，評估PCR反應(yīng)中抑制物的存在和作用情況。為指導(dǎo)DNA提取和PCR擴(kuò)增提供參考。 結(jié)論：本