接觸DNA檢材提取純化方法的比較及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、接觸DNA(touch DNA)檢驗(yàn)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。法醫(yī)鑒定中的接觸DNA檢材,是指含有人體皮膚粘膜的脫落細(xì)胞的檢材,包括含口腔脫落細(xì)胞的檢材、含體表脫落細(xì)胞的檢材、人體排泄物或分泌物等。凡是與人體皮膚粘膜接觸過(guò)的物品,都可能留下接觸者的脫落細(xì)胞。這些留有脫落細(xì)胞的物證可以存在于犯罪現(xiàn)場(chǎng),也可存在于犯罪嫌疑人及被害對(duì)象的衣物、用具等客體上。隨著犯罪分子反偵察手段的日益狡猾,明顯的生物物證(精斑、血斑、毛發(fā)、人體組織等)

2、常被有目的地銷毀和破壞,而來(lái)自人體的代謝脫落細(xì)胞由于微小痕量,常被忽略,如遺留在煙蒂、飲料罐、果核、口香糖上的口腔脫落上皮細(xì)胞,遺留在手套、衣物、帽子、指紋上的皮膚脫落上皮細(xì)胞,等等。對(duì)于這些潛在的微量生物物證,一旦成功地獲得了關(guān)鍵物證的DNA分型,往往就能夠成為案件偵破的關(guān)鍵線索,并為案件定性及法庭量刑提供科學(xué)證據(jù)。
　　 如何從微量接觸檢材中提取到足夠的DNA以滿足法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的需要,選擇合適的提取方法非常關(guān)鍵,是法醫(yī)物證檢驗(yàn)

3、工作者最關(guān)注的難題之一。接觸DNA檢材與常見(jiàn)的生物檢材如血痕、精斑相比,屬于疑難生物檢材。首先,肉眼觀察很難判斷接觸細(xì)胞在載體上的具體部位,盲目提取難以獲得所需靶細(xì)胞；其次,擦拭面積太大會(huì)降低靶DNA的濃度,并帶來(lái)外源物質(zhì)的污染和干擾；第三,接觸DNA檢材含有的DNA往往是微量的,屬于低拷貝數(shù)目(Low copy number,LCN)模板,即“DNA含量少于100pg,相當(dāng)于15個(gè)雙倍體或30個(gè)單倍體細(xì)胞的生物樣本”。因此接觸DNA檢

4、驗(yàn)不同于常規(guī)生物檢材的DNA檢驗(yàn),更需系統(tǒng)研究。
　　 目前關(guān)于接觸DNA提取純化方法的文獻(xiàn)很多,概括起來(lái)有Chelex法、磁珠法、有機(jī)溶劑法(有機(jī)法)、過(guò)柱法、硅珠法、硅膠膜法等。但多為針對(duì)某種方法對(duì)某種類型接觸DNA的提取或案例報(bào)道,對(duì)不同提取純化方法獲得的現(xiàn)場(chǎng)不同類型的接觸DNA的質(zhì)與量的橫向比較缺乏系統(tǒng)研究。本研究采用Quantifiler人類DNA定量試劑盒(AB,USA)實(shí)時(shí)定量技術(shù)對(duì)目前常用的提取純化方法包括Che

5、lex法、磁珠提取法(DNA IQ磁珠法、EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法)、有機(jī)溶劑提取法、Microton過(guò)柱法提取的接觸DNA進(jìn)行定量,同時(shí)用Identifiler或Sinofiler復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)(AB,USA)擴(kuò)增,在AB 3130遺傳分析儀上進(jìn)行STR(short tandemrepeat,短串聯(lián)重復(fù))分型。綜合DNA定量和STR分型結(jié)果,對(duì)各種提取純化方法獲得的DNA的質(zhì)和量進(jìn)行評(píng)估和系統(tǒng)比較,以建立有效的接觸DNA提取純化方法。
　　

6、 1.Chelex法提取接觸DNA的實(shí)時(shí)定量研究
　　 對(duì)使用后放置1個(gè)月以內(nèi)的30個(gè)飲料瓶口或吸管、30個(gè)礦泉水瓶(杯)口分別采用不洗滌直接加Chelex-100提取與洗滌+Chelex-100的方法提取DNA,通過(guò)PCR定量和STR檢測(cè),比較2種處理方式獲得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR檢驗(yàn)成功率；對(duì)使用后放置1個(gè)月以內(nèi)的10個(gè)新鮮飲料瓶口或吸管,使用后分別放置1個(gè)月和放置2個(gè)月的20把牙刷、20枚煙蒂,分別采用

7、洗滌+Chelex-100和洗滌+Chelex-100+蛋白酶K(PK)的方法提取DNA,通過(guò)PCR定量和STR檢測(cè),比較2種處理方式獲得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR檢驗(yàn)成功率。研究結(jié)果表明,Chelex-100提取前加浸泡洗滌的步驟,可去除部分可溶性雜質(zhì),有利于提高獲得的DNA量和STR檢驗(yàn)成功率,同時(shí)降低反映PCR抑制物存在的IPC Ct值。室溫放置1個(gè)月左右的新鮮接觸DNA檢材用Chelex法提取時(shí),是否加蛋白酶K對(duì)提

8、取的DNA量和STR檢驗(yàn)成功率無(wú)顯著影響；室溫放置2個(gè)月以上的接觸DNA檢材用Chelex法提取時(shí),加蛋白酶K消化后獲得的DNA量和STR檢驗(yàn)成功率均高于不加蛋白酶K的樣品,差異有顯著性意義。本研究對(duì)180份10種實(shí)際案件的接觸DNA檢材用Chelex法提取,煙蒂獲得的平均DNA含量最高達(dá)175.85 ng,剃須刀較低為7.80 ng。除煙蒂、口香糖采用常規(guī)體系提取外,其它檢材采用小體系提取,平均DNA濃度均在0.2ng/μl以上,采用

9、2 μl模板復(fù)合擴(kuò)增,除衣服、剃須刀的STR分型成功率較低為50％外,其它檢材的STR分型成功率均在60％以上。
　　 2.磁珠法提取接觸DNA的實(shí)時(shí)定量研究
　　 對(duì)煙蒂、牙刷、手套等3種接觸DNA檢材各10個(gè)分別采用95℃裂解液直接裂解、70℃μ裂解液直接裂解和預(yù)消化(TNE+SDS+PK)等3種前處理方式后用DNA IQ磁珠(Promega,USA)提取DNA,測(cè)定并比較三種前處理方式后用DNA IQ磁珠法提取獲得

10、的DNA平均含量和IPC Ct值。研究結(jié)果表明,接觸DNA檢材采用先加TNE、SDS、PK等消化,然后再用磁珠純化的方法獲得的DNA量高于單純用裂解液裂解的方法提取的DNA量,有助于提高微量和污染接觸DNA檢材的STR檢驗(yàn)成功率。但該處理方法操作相對(duì)繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),除了污染嚴(yán)重的微量接觸DNA檢材外,大部分接觸DNA檢材單純采用直接裂解法就可以獲得足以進(jìn)行STR分析的DNA。裂解溫度方面,95℃裂解與70℃裂解的DNA獲得量無(wú)顯著性差異。

11、對(duì)151份8種實(shí)際案件的接觸DNA檢材采用95℃直接裂解的DNAIO磁珠法在MaxwellTM 16自動(dòng)儀上提取DNA。結(jié)果表明除果核平均DNA獲得量為9.51ng以外,其它7種接觸檢材的平均DNA獲得量均大于10ng。采用30μl的小洗脫體積,平均DNA濃度可達(dá)0.3ng/μl,采用8N體系3μl模板擴(kuò)增,檢驗(yàn)成功率最低的果核也達(dá)60％。EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法與DNA IQ磁珠法相比,不僅價(jià)格便宜,還少了1個(gè)裂解液洗滌和1個(gè)洗滌液洗滌的步驟,

12、操作更為簡(jiǎn)單,但對(duì)接觸DNA的提取效率無(wú)顯著性差異。對(duì)138份6種實(shí)際案件的接觸DNA檢材在自動(dòng)化工作站經(jīng)EO國(guó)產(chǎn)磁珠法提取DNA,采用8μl體系391模板擴(kuò)增,除對(duì)飲料瓶口的檢驗(yàn)成功率較低,為60％外,對(duì)煙蒂、口香糖、手套等接觸DNA檢材的檢驗(yàn)成功率也能達(dá)到70％以上。因此也適合接觸DNA的提取。
　　 3.5種接觸DNA檢材提取純化方法的比較
　　 將稀釋為10ng、100ng的標(biāo)準(zhǔn)品DNA,分別采用Chelex法、

13、DNA IQ磁珠法、EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法、有機(jī)法、Microton過(guò)柱法等5種DNA提取純化方法處理,然后進(jìn)行PCR定量,比較5種DNA提取純化方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的回收率。對(duì)煙蒂和牙刷2種常見(jiàn)的接觸DNA檢材分別采用Chelex法、95℃直接裂解的DNA IQ磁珠法和EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法提取DNA,通過(guò)PCR定量和STR檢測(cè)分析,比較3種提取方法提取的DNA平均含量、IPC Ct值和STR檢驗(yàn)效果；對(duì)30例污染嚴(yán)重的接觸DNA檢材,先用TNE、SD

14、S、PK消化,然后將消化液平均分成2份,1份用DNA IQ磁珠法純化,1份用有機(jī)法抽提,通過(guò)PCR定量和STR檢測(cè)分析,比較磁珠法與有機(jī)法對(duì)接觸DNA的純化效果:將Chelex法提取的15例5種接觸DNA溶液用Microcon100超濾柱進(jìn)行純化濃縮,通過(guò)PCR定量和STR檢測(cè)分析,比較Microcon過(guò)柱法濃縮前后的濃度、體積、IPC Ct值及回收率。結(jié)果表明,Chelex法對(duì)DNA的提取無(wú)損失,磁珠法、有機(jī)法、Microcon過(guò)柱法

15、對(duì)DNA的提取純化均有不同程度的損失。5種提取純化方法對(duì)DNA的回收率從高到低大致為Chelex法>Microcon過(guò)柱法>DNA IQ磁珠法>EQ國(guó)產(chǎn)磁珠法>有機(jī)法。Chelex法提取DNA,操作簡(jiǎn)單快速,整個(gè)提取過(guò)程均在一個(gè)離心管中進(jìn)行,避免了DNA在提取過(guò)程中的損耗,對(duì)污染輕、雜質(zhì)少的接觸DNA檢材,用Chelex法提取最為方便快捷。但Chelex法不能去除DNA溶液中的雜質(zhì)和降解的DNA碎片,因此,Chelex法提取的陳舊接觸檢

16、材的DNA進(jìn)行STR擴(kuò)增時(shí),即使模板量在試劑盒推薦的范圍內(nèi),也容易出現(xiàn)等位基因擴(kuò)增不平衡的現(xiàn)象。磁珠法與Chelex法相比,雖然提取過(guò)程中會(huì)造成DNA的損失,但提取的DNA純度高,能有效去除100bp以下的DNA小片段和樣品中的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),因此,STR擴(kuò)增時(shí)峰高比較均衡,等位基因擴(kuò)增不平衡的現(xiàn)象不明顯。磁珠法與有機(jī)法對(duì)接觸DNA的回收量和IPC Ct值雖然無(wú)顯著性差異,但磁珠法避免了有機(jī)溶劑對(duì)操作者的潛在危害,操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,

17、因此,更適合微量、污染檢材的DNA提取及自動(dòng)化操作。Microcon過(guò)柱法操作簡(jiǎn)單,但對(duì)接觸DNA的回收效果不一,100μl的起始體積,過(guò)柱濃縮后的體積在8～25μl之間,平均為15μl。過(guò)柱后,DNA濃度平均約增加5倍,對(duì)DNA的回收率平均為61％,但反映PCR抑制物存在的IPC Ct值無(wú)顯著降低。同時(shí),Microcon過(guò)柱法的成本也高于磁珠法。因此,Microcon過(guò)柱法對(duì)接觸DNA的提取純化應(yīng)用有限,只適合污染輕的接觸DNA的純化