一氧化碳對脂多糖誘導(dǎo)的新生鼠急性肺損傷的抑制作用及其機制研究.pdf

1、急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是由于各種直接或間接的致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，表現(xiàn)為肺的順應(yīng)性下降、頑固性的低氧血癥、高碳酸血癥、呼吸窘迫，最終發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distresssyndrome，ARDS)。ALI的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前還沒有完全闡述清楚。以往研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是誘發(fā)和加重ALI的決定性因素。當(dāng)機體受到外源性刺激或者自身生理機能

2、紊亂時，免疫系統(tǒng)被激活，引起相關(guān)趨化因子和炎性因子的釋放以及中性粒細(xì)胞的大量聚集，以抵抗和清除對機體有害的各種因素。而炎癥反應(yīng)對機體自身也存在傷害作用，過度的炎癥反應(yīng)會加重生理機能受損，在肺組織中主要表現(xiàn)為肺的血氣交換屏障受損。與成年人相比，新生兒的肺泡發(fā)育還不夠完善，自身調(diào)節(jié)能力有限，很容易受到各種外來刺激的影響而發(fā)生功能障礙。1989年，F(xiàn)aix等率先報道了11例足月新生兒ALI/ARDS，之后相繼有足月新生兒、早產(chǎn)兒、低體重兒等多

3、種類型ALI/ARDS的病例報道。近年來，有關(guān)新生兒ALI/ARDS的報道越來越多，研究中發(fā)現(xiàn)，新生兒ALI與成人和兒童均有所不同，其起病更快，病程進展更迅速，低氧血癥更為嚴(yán)重。在新生兒ALI的誘發(fā)因素中，胎糞吸入和感染是最常見的兩個發(fā)病原因。一氧化碳(Carbonmonoxide，CO)在體內(nèi)微量存在，主要由血紅素加氧酶(Heme oxygenase，HO)分解血紅素生成。目前的研究表明，CO在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理調(diào)節(jié)作用，包括擴張血

4、管、抗炎癥、抗凋亡、抗細(xì)胞增殖等作用。在各種ALI的動物模型中發(fā)現(xiàn)，低劑量的CO具有明顯減輕ALI的作用，其機制研究主要集中在CO的抗炎癥作用方面。而對于CO的抗凋亡作用，尤其是對肺泡二型上皮細(xì)胞(Alveolar typeⅡ epithelial cells，AEC-Ⅱ)的凋亡影響迄今還未見報道。
　　目的：
　　探討CO對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的新生鼠ALI時AEC-Ⅱ凋亡的影響及其分

5、子機制。
　　方法：
　　一、CO對LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的影響
　　1.創(chuàng)建LPS誘導(dǎo)新生鼠ALI模型，通過觀察肺組織病理變化，濕干比(Wet-to-dryratio，W/D)，肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量變化確定模型建立是否成功;
　　2.制備失活性一氧化碳釋放分子3(Inactive carbon monoxide releasin

6、g molecule3，iCORM3):將制備好的一氧化碳釋放分子3(Carbon monoxide releasing molecule3，CORM3)于室溫下放置18h，使CORM3充分分解釋放出CO氣體，剩下的部分即為羰基骨架結(jié)構(gòu)iCORM3;
　　3.觀察CORM3對LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的保護作用，觀察指標(biāo):H-E染色，W/D比值、BALF中白細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量變化;
　　4.觀察CORM3對LPS誘導(dǎo)的新生鼠A

7、EC-Ⅱ凋亡的影響，末端標(biāo)記法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)染色觀察肺泡細(xì)胞凋亡情況，TUNEL+肺表面活性物質(zhì)C(Surfactant protein C，SP-C)免疫熒光觀察AEC-Ⅱ凋亡變化。
　　二、CO對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡影響
　　1.MTT法觀察不同濃度LPS對A549細(xì)胞活力的影響;<

8、br>　　2.MTT法觀察不同濃度CORM3對LPS刺激的A549細(xì)胞活力的影響;
　　3.TUNEL法觀察CORM3對LPS刺激的A549細(xì)胞凋亡的影響;
　　4.JC-10染色觀察線粒體膜電位變化;
　　5.蛋白免疫印跡法(Western-Blot，WB)檢測線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C(Cytochrome C)含量變化;
　　6.酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent a

9、ssay，Elisa)檢測活化的Caspase3變化。
　　結(jié)果：
　　一、CO對LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI的影響
　　1.與control組相比，LPS組肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肺間隔明顯增寬，肺泡及其間質(zhì)內(nèi)大量中性粒細(xì)胞堆積;W/D比值、BALF細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CORM3組與LPS相比，肺組織病理變化明顯改善，肺泡及間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少;W/D比值、BALF中自細(xì)胞

10、數(shù)目及蛋白含量升高趨勢明顯回落，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。iCORM3組與LPS組相比，上述觀察與檢測指標(biāo)無明顯變化(P＞0.05)。說明在LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI中，CORM3能起到明顯的抑制作用。
　　2.與control組相比，LPS組肺組織AEC-Ⅱ凋亡明顯增加，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CORM3組與LPS相比，肺組織AEC-Ⅱ凋亡數(shù)目明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);iCORM3組

11、與LPS組相比，上述指標(biāo)無明顯變化(P＞0.05)。說明在LPS誘導(dǎo)的新生鼠ALI中存在AEC-Ⅱ凋亡，CORM3干預(yù)能抑制新生鼠ALI中的AEC-Ⅱ凋亡。
　　二、CO對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡影響
　　1.隨著LPS作用濃度的增加，A549細(xì)胞活力明顯下降，其趨勢變化在100-400ug/ml濃度之間最為顯著(P＜0.05)。
　　2.與LPS組相比，給予CORM3干預(yù)后，A549細(xì)胞活力明顯增強，且增強趨勢與

12、CORM3濃度呈正相關(guān);iCORM3組與LPS組相比無明顯變化(P＞0.05)。
　　3.與control組相比，LPS組TUNEL熒光信號明顯增強，提示A549細(xì)胞凋亡增多，二者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);CORM3組與LPS相比，A549細(xì)胞凋亡數(shù)目有所減少，二者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);而iCORM3組無明顯變化（P＞0.05）。
　　4.在control組中，JC-10以聚合體形式存在于線粒體內(nèi)膜中

13、，顯微鏡下顯示紅色熒光信號，線粒體膜電位水平較高;LPS組JC-10主要以單體形式存在，顯微鏡下以綠色熒光為主，說明線粒體膜電位下降明顯;給予CORM3干預(yù)后，細(xì)胞線粒體膜電位有所回升，而iCORM3組無明顯變化。
　　5.在control組中，Cytochrome C主要存在于線粒體中，胞漿含量較少;經(jīng)LPS刺激后，線粒體內(nèi)Cytochrome C有所減少，胞漿內(nèi)Cytochrome C含量增多;給予CORM3干預(yù)后，線粒體內(nèi)C

14、ytochrome C逐漸增多;在iCORM3組中，線粒體內(nèi)Cytochrome C含量與LPS組相比無明顯變化。這些結(jié)果表明:LPS刺激后，線粒體膜電位降低，通透性增強，線粒體內(nèi)Cytochrome C轉(zhuǎn)移進入胞漿中，給予CORM3干預(yù)后，抑制了線粒體內(nèi)Cytochrome C進入胞漿的趨勢。
　　6.與control組相比，給予LPS刺激以及CORM3治療，Caspase3活性均無明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論：<