商陸組織培養(yǎng)及綠色熒光蛋白基因工程菌構(gòu)建.pdf

1、商陸（Ｐhytolaccaceae)為商陸科多年生草本植物，我國具有豐富的野生資源。商陸被廣泛用于醫(yī)藥、病蟲害防治、食品著色以及植物修復(fù)等方面。但是由于野生型商陸的生長周期比較長，而且商陸自身具有毒性，商陸的栽培和應(yīng)用受到很大的困擾。因此，開發(fā)商陸的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，從分子層面上來研究商陸，對我們更深入的研究商陸富集重金屬的機(jī)理及其與食品安全之間的關(guān)系，以及研究開發(fā)無毒或低毒、次生代謝產(chǎn)物高產(chǎn)植株、多種重金屬富集植株、速生等轉(zhuǎn)基因新品種具有

2、重要的意義。這將為我國商陸的進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定一個良好的基礎(chǔ)。
　　 本研究對商陸種子快速萌發(fā)及無菌苗培養(yǎng)的條件、商陸高效再生體系的建立、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)化商陸愈傷組織的參數(shù)及轉(zhuǎn)化腋芽原基的參數(shù)、轉(zhuǎn)化植株的篩選、轉(zhuǎn)化植株的鑒定等開展了系列研究，得出的主要結(jié)論如下：
　　 1、商陸種子萌發(fā)及無菌苗培養(yǎng)的最適條件為：商陸種子在酸性消毒液中處理15min，然后接種在MS+20g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂培養(yǎng)基上，26±

3、1℃
　　 下暗培養(yǎng)1W，萌發(fā)率為96.7％，沒有污染現(xiàn)象。隨后，將光照強(qiáng)度調(diào)為1500LUX、光/暗周期12h/12h，2W 后可以成苗，成苗率100％。
　　 2、商陸高效再生體系的建立：我們以商陸的葉片、葉柄、莖段和莖節(jié)為外植體，以附加一定植物激素的MS 培養(yǎng)基為誘導(dǎo)愈傷組織和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以附加不同濃度的IBA的MS 培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基，建立了商陸高效再生體系。其中（1）愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素配比為：葉片： 6-

4、BA 2.0 mg/L，IBA 0.4mg/L；莖段：6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；葉柄： 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；在最適培養(yǎng)基上所有外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率都為100％。（2）莖節(jié)腋芽分化增殖最佳激素配比為6-BA 1.0 mg/L，IBA0.2mg/L；（3）最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 7.0 g/L；
　　 3、商

5、陸外植體對抗生素卡那霉素（Km）和潮霉素（Hyg）的敏感性不同，潮霉素50 mg/L 就可以完全抑制商陸外植體愈傷組織的產(chǎn)生和分化，而卡那霉素.則需要 100 mg/L；但分化芽的生根對卡那霉素和潮霉素都十分敏感，少量抗生素就可以完全抑制商陸分化芽的生根。
　　 4、以中間載體PBI121 為基礎(chǔ)，以EGFP 序列為目的片段插入DNA，構(gòu)建了在植物中可以表達(dá)的中間表達(dá)載體。通過PCR和酶切驗(yàn)證，表明中間表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功，并已