CAR胞外段多克隆抗體的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、1997年通過免疫親和層析的方法從HeLa細(xì)胞中分離和鑒定出柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus,Cox)和腺病毒(Adenovirus,Ad)的共用受體(Coxsackievirus—Adenovirus Receptor,CAR),并獲得該受體的cDNA克隆<'[1][2][3]>.隨著對(duì)CAR結(jié)構(gòu),分布和功能研究的深入,CAR在致病機(jī)制,細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),抗病毒疫苗設(shè)計(jì)及以Ad載體為基礎(chǔ)的腫瘤基因治療中的作用也日益受到廣泛關(guān)注

2、.該課題在利用原核基因工程制備了抗CAR抗體的基礎(chǔ)上,探討了不同腫瘤細(xì)胞中Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)CAR的表達(dá)及亞細(xì)胞分布的影響,并對(duì)CAR表達(dá)與Ad易感性的關(guān)系進(jìn)行了初步研究.全文分以下三個(gè)方面進(jìn)行總結(jié):一、CAR胞外域基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備 研究CAR的表達(dá)、分布及功能等都離不開抗體的應(yīng)用,為此我們利用原核基因工程克隆表達(dá)CAR胞外段并制備多克隆抗體.具體方法是從HeLa細(xì)胞中抽提總RNA,通過RT-PCR獲得

3、編碼CAR胞外段的cDNA,與pQE31質(zhì)粒連接,構(gòu)建表達(dá)型重組質(zhì)粒,測(cè)序證實(shí)后誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)Ni—NTA柱親和純化后,免疫新西蘭兔,ELISA檢測(cè)抗血清滴度.二、抑制Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑上調(diào)CAR的表達(dá) 以Ad載體為基礎(chǔ)的基因治療開辟了腫瘤治療的新領(lǐng)域,隨著對(duì)Ad載體研究的深入,介導(dǎo)Ad吸附靶細(xì)胞的受體——CAR也日益受到普遍關(guān)注,因?yàn)闆Q定Ad成功進(jìn)入靶細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵因素就是細(xì)胞表面CAR的表達(dá).三、細(xì)胞表面CAR表達(dá)上調(diào)

4、促進(jìn)腺病毒感染靶細(xì)胞 Ad是無包膜的DNA病毒,通過特異性受體介導(dǎo)的胞內(nèi)吞(endocytosis)方式進(jìn)入宿主細(xì)胞,而CAR代表Ad與靶細(xì)胞結(jié)合的主要位點(diǎn)<'[17][18]>,因此我們推想如果細(xì)胞表面CAR表達(dá)水平上調(diào),是否會(huì)易化Ad的感染,導(dǎo)致Ad進(jìn)入靶細(xì)胞的數(shù)量增多.為了驗(yàn)證這個(gè)想法,我們選擇了能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的非復(fù)制型,E<,1>A缺陷的Ad感染人肝癌細(xì)胞SMMC-7721及HepG<,2,FACS分析U0126處