CAR胞外段多克隆抗體的制備及應用研究.pdf

1、1997年通過免疫親和層析的方法從HeLa細胞中分離和鑒定出柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus,Cox)和腺病毒(Adenovirus,Ad)的共用受體(Coxsackievirus—Adenovirus Receptor,CAR),并獲得該受體的cDNA克隆<'[1][2][3]>.隨著對CAR結構,分布和功能研究的深入,CAR在致病機制,細胞信號傳導,抗病毒疫苗設計及以Ad載體為基礎的腫瘤基因治療中的作用也日益受到廣泛關注

2、.該課題在利用原核基因工程制備了抗CAR抗體的基礎上,探討了不同腫瘤細胞中Raf-MEK-ERK信號轉導途徑對CAR的表達及亞細胞分布的影響,并對CAR表達與Ad易感性的關系進行了初步研究.全文分以下三個方面進行總結:一、CAR胞外域基因的原核表達及多克隆抗體的制備 研究CAR的表達、分布及功能等都離不開抗體的應用,為此我們利用原核基因工程克隆表達CAR胞外段并制備多克隆抗體.具體方法是從HeLa細胞中抽提總RNA,通過RT-PCR獲得

3、編碼CAR胞外段的cDNA,與pQE31質(zhì)粒連接,構建表達型重組質(zhì)粒,測序證實后誘導表達,經(jīng)Ni—NTA柱親和純化后,免疫新西蘭兔,ELISA檢測抗血清滴度.二、抑制Raf-MEK-ERK信號傳導途徑上調(diào)CAR的表達 以Ad載體為基礎的基因治療開辟了腫瘤治療的新領域,隨著對Ad載體研究的深入,介導Ad吸附靶細胞的受體——CAR也日益受到普遍關注,因為決定Ad成功進入靶細胞的一個關鍵因素就是細胞表面CAR的表達.三、細胞表面CAR表達上調(diào)

4、促進腺病毒感染靶細胞 Ad是無包膜的DNA病毒,通過特異性受體介導的胞內(nèi)吞(endocytosis)方式進入宿主細胞,而CAR代表Ad與靶細胞結合的主要位點<'[17][18]>,因此我們推想如果細胞表面CAR表達水平上調(diào),是否會易化Ad的感染,導致Ad進入靶細胞的數(shù)量增多.為了驗證這個想法,我們選擇了能表達綠色熒光蛋白(GFP)的非復制型,E<,1>A缺陷的Ad感染人肝癌細胞SMMC-7721及HepG<,2,FACS分析U0126處