改良擴增前引物延伸方法的法醫(yī)學應用研究.pdf

1、研究背景與目的 在法醫(yī)學檢案實踐中，常遇到樣本DNA含量極其有限，以致DNA分型無法完成或不能滿足重復檢測的需要。因此，對微量模板DNA分析便成為法醫(yī)學DNA檢驗的一個難題。以PCR-STR為代表的遺傳標記分析技術雖然一定程度上解決了法醫(yī)學微量檢材的難題，但一些檢材仍因DNA含量極其有限而無法檢測成功，或僅檢出少數基因座而無法使累計鑒別能力達到認定水平。這類檢材被稱為痕量DNA，也稱低拷貝模板(low copy number，L

2、CN)，Gill等將其定義為低于100pg的模板DNA。為解決這一難題，有研究用增加PCR循環(huán)數，但模板DNA量太低時易產生等位基因丟失或非特異帶，且循環(huán)數增加到一定程度后再增加循環(huán)數也不會顯著增加靈敏度；另外，有人試圖用巢式PCR，但巢式PCR技術僅限于單一位點分析，無法提高目前法醫(yī)學中常規(guī)DNA檢測所用的多位點復合擴增所需的模板數量。全基因組擴增(Whole Genome Amplification，WGA)是一種能從有限的DNA樣

3、品獲得充足的DNA量供后續(xù)分析的技術，其基本思路是通過對微量組織甚至單個細胞的整個基因組DNA擴增，大幅度增加DNA的總量。因此被認為是目前可以解決上述難題的一種有效方法。 WGA技術經10余年探索，在方法上已逐步發(fā)展和不斷完善起來，已被廣泛用于疾病基因研究等領域，并取得了良好的效果。但在法醫(yī)學方面的應用很少。在目前常用的幾種wGA方法中，改良擴增前引物延伸方法(Improved primerextension preampli

4、fication，IPEP)和多重置換擴增方法(multipledisplacement amplification，MDA)對STR基因座分型顯示出較好的效果。故本研究探討了這兩種方法用于法醫(yī)學微量檢材的效果，包括對其靈敏度、擴增忠實性、能否用于法醫(yī)學常用STR基因座及常用檢材等進行系統(tǒng)性研究，從而對其用于法醫(yī)學實踐的可行性進行評價，并建立穩(wěn)定可行的技術方案。 方法：1．對30例口腔拭子樣品，采用酚－氯仿法提取DNA，實時熒光

5、定量PCR技術定量，并分別稀釋成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng六種模板量DNA，然后進行MDA反應和IPEP反應。采用實時熒光定量PCR技術檢測MDA方法和IPEP方法的產物濃度，比較兩種方法的擴增效率。分別以MDA產物和IPEP產物為模板DNA，用AmpFLSTR Identifiler 試劑盒擴增，ABl3100基因分型儀檢測基因型，比較MDA產物和IPEP產物用于STR分型的效果。

6、 2．對IPEP方法反應體系的成分和終濃度進一步優(yōu)化，建立改良IPEP方法，并檢測其擴增效率和STR分型效果。將改良IPEP方法用于30例血液、30例血紗、30例精液等三類法醫(yī)學常見生物檢材進行檢測，觀察改良IPEP方法的可重復性和對法醫(yī)學常見生物性檢材的適用性。 3．將改良IPEP方法用于20例汗?jié)撝赣　?0例一次性牙刷、20例自然脫落頭發(fā)等三種法醫(yī)學常見疑難微量檢材的模擬案例，觀察改良IPEP方法對上述檢材的STR分型效果

7、；用于現場果核10例、礦泉水瓶10例、煙蒂10例、衣領10例等實際案例樣品，觀察改良IPEP方法對實際案件中微量DNA樣品的檢驗效果。 結果 1．MDA法產量為5.15μg～19.75μg，可對模板DNA增加5.15×10<'3>～1.98×10<'6>倍；IPEP法產量為0.5ng～66ng，可對模板DNA增加25～310倍。MDA法產物濃度高于IPEP法，差異有顯著性意義(F=3643.433，P<0.001)。

8、 2．常規(guī)檢測法、MDA法、IPEP法的基因座檢出數有顯著性差異(F=1033.297，P<0.001)。當DNA模板量為1ng時，常規(guī)檢測方法、MDA方法、IPEP方法均可獲得復合擴增系統(tǒng)所有基因座的準確分型結果；當DNA模板量為0.5ng時，常規(guī)檢測方法和IPEP方法均獲得所有基因座的準確分型結果，MDA法獲得10個以上基因座的準確分型結果；當DNA模板量為0.1ng～0.01ng時，MDA法基因座檢出數高于常規(guī)檢測法，IPEP

9、法基因座檢出數高于MDA法。3．DNA模板量≥1ng，其MDA產物雜合子基因座的等位基因擴增均衡：DNA模板量≤0.5ng，其MDA產物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失現象，且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丟失現象越明顯。DNA模板量≥0.05ng，其IPEP產物雜合子基因座的等位基因擴增均衡；DNA模板量≤0.025ng，其IPEP產物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失。MDA產物和IPEP產物用于STR分型時均未觀

10、察到非特異產物峰。 4．采用保真性更好的DNA聚合酶和增加隨機引物用量，建立了改良IPEP方法。0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng四組模板量DNA經改良IPEP法擴增所得產物濃度均高于IPEP法，差異有顯著性(F=289.899，P<0.001)。改良IPEP法對上述模板DNA擴增獲得3ng～84ng產物，可使模板DNA增加160～1220倍。DNA模板量為0.025ng時，改良IPEP方法可獲得完整準確的分

11、型結果。DNA模板量為0.01ng時，改良IPEP法的平均基因座檢出數高于IPEP法，部分基因座仍未檢出，以D7S820、D18S51、FGA等較常見。改良IPEP方法的產物用于STR分型時，未見非特異產物峰及等位基因不平衡或丟失。 5．改良IPEP方法對0.025ng血液DNA、血紗DNA、精液DNA檢測均獲得所有基因座的準確分型結果。 6．改良IPEP方法可顯著提高汗?jié)撝赣NA(t=5.423，P<0.001)、一

12、次性牙刷DNA(t=6.835，P<0.001)的基因座檢出數，但對自然脫落毛發(fā)DNA的基因座檢出數低于常規(guī)檢測法(t=3.249，P<0.001)。改良IPEP方法對實際案件中果核、杯口、煙蒂、衣領等檢材的的檢測成功率和平均基因座檢出數均高于常規(guī)檢測方法，且檢出STR基因座數均不少于9個。 結論 1．MDA法產量高，但靈敏度低，當模板量低于1ng時，產物序列保真性差，影響后續(xù)STR分型的準確性。因此，MDA法可能不適用

13、于痕量DNA檢測。 2．IPEP法靈敏度高，產物序列保真性好，對0.05ng的基因組DNA可獲得良好的STR分型效果，但產量低。 3．DNA聚合酶和隨機引物用量對IPEP方法有重要影響。采用保真性更好的DNA聚合酶和增加隨機引物至一定終濃度，提高了擴增效率。在此基礎上建立的改良IPEP方法的產物序列保真性好，且產量和靈敏度都進一步提高，改善了痕量DNA的STR分型效果。 4．改良IPEP方法對于口腔拭子、血液、血