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文檔簡介
1、目的:驗證京尼平苷是否通過作用P38MAPK通路,尋找京尼平苷抗兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的相關(guān)機(jī)制,從而為臨床應(yīng)用京尼平苷防治軟骨細(xì)胞類疾病提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
方法:(1)24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為:A正常組6只;B4周模型組6只;C8周模型組12只。對B、C組新西蘭大白兔采取改良Hulth法(既去除內(nèi)側(cè)半月板,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶)制造兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型,于飼養(yǎng)8周后將A、B、C組動物統(tǒng)一處死,取關(guān)節(jié)軟骨組織 HE染色及
2、檢測關(guān)節(jié)液 IL-1、TNF-α對模型鑒定。(2)無菌提取A、C組軟骨組織,消化軟骨間質(zhì),分離軟骨細(xì)胞,無菌培養(yǎng)。甲苯胺藍(lán)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫熒光鑒定軟骨細(xì)胞。檢測 A、C組細(xì)胞培養(yǎng)液 IL-1、TNF-α的濃度用于鑒定骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。(3)用MTT檢測京尼平苷對骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作用的最適時間及濃度。(4)將軟骨細(xì)胞分成 D:生理鹽水組、E:京尼平苷組、F:京尼平苷+P38抑制劑組、G:P38抑制劑組,分別培養(yǎng)并分別檢測檢測各
3、組P38MAPK通路上游介質(zhì)NO含量;(5)ELISA測定各組P38MAPK通路下游介質(zhì)MMP-13含量;(6)實時熒光定量PCR檢測P38mRNA;(7) Western-Blot測定各組P38MAPK通路蛋白的表達(dá)。各項數(shù)據(jù)釆用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:(1)通過形態(tài)學(xué)及各項生化指標(biāo)表明兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功。8周后ELISA檢測IL-1、TNF-α結(jié)果發(fā)
4、現(xiàn),與A組相比,B、C組IL-1、TNF-α顯著升高(P<0.05)。(2)原代兔膝OA軟骨細(xì)胞呈多角形,培養(yǎng)72h后基本貼壁,傳代后細(xì)胞生長加快,隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞逐漸出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,呈圓形,多短觸角;II型膠原免疫組織細(xì)胞技術(shù)、II型膠原免疫熒光法、甲苯胺藍(lán)染色法測得細(xì)胞為軟骨細(xì)胞來源,(3)隨著給藥濃度的不同(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml)對兔膝OA軟骨細(xì)胞增殖
5、有明顯的促進(jìn)作用,京尼平苷于濃度為10μg/ml培養(yǎng)72h對軟骨細(xì)胞增殖作用最佳(P<0.05);(4)生化檢測NO結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組相比,京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組NO表達(dá)量顯著下降(P<0.05);(5)ELISA檢測MMP-13結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組相比,京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組MMP-13表達(dá)量顯著下降(P<0.05);(6) PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組相比,京尼平
6、苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組P38mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05);(7) Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組相比,京尼平苷組、京尼平苷+P38抑制劑組、P38抑制劑組P38/GAPDH表達(dá)量無差異(P>0.05);京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組P-p38/GAPDH表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。
結(jié)論:京尼平苷對體外培養(yǎng)的兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有一定的增殖作用,并
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