新型siRNA表達載體、隨機siRNA文庫的構(gòu)建及基于隨機siRNA文庫的細胞增殖相關(guān)基因篩選.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學中國醫(yī)學科學院博士學位論文新型siRNA表達載體、隨機siRNA文庫的構(gòu)建及基于隨機siRNA文庫的細胞增殖相關(guān)基因篩選姓名：張麗姝申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：沈巖梁子才20050501!璺!!塑墾型至堂豎主堡莖!蘭塑塞DNA。我們選擇化學合成質(zhì)量符合要求的隨機序列大量克隆到載體，構(gòu)建了siRNA瞬時表達文庫pBUH—RSL。pBUH_RSL文庫的獨立克隆數(shù)為5107；其中有效克隆占‘90％：隨

2、機siRNA編碼區(qū)的GC含量40％。在此基礎(chǔ)上我們用轉(zhuǎn)移pBUtIRSL文庫編碼框的方法構(gòu)建了一個真核穩(wěn)定表達siRNA文庫pCUH，文庫的獨立克隆_RSL數(shù)為1108，有效克隆98％，小量測序未發(fā)現(xiàn)文庫序列多拷貝重復(fù)的情況。我們用pCUH文庫進行了細胞增殖相關(guān)基因的篩選研究。文庫_RSLpCUHRSL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3El細胞，在G418的選擇壓力F傳代培養(yǎng)60天。這樣，因表達某種siRNA而獲得增殖加快表型的細胞會在連續(xù)的細胞傳代過

3、程中逐漸得到富集。收集篩選結(jié)束時的細胞，此時轉(zhuǎn)染文庫組細胞的增殖速度明最快于陰性對照細胞，提示文庫中的某些成員的確起到了促進細胞增殖的作用。通過PCR／克?。瘻y序的方法獲知這些細胞中所轉(zhuǎn)染的siRNA序列。當表達這些siRNA的pCUH質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)染MC3T3E1細胞，一些siRNA再次明顯的促進了細胞增殖，如cloneB7，B38，A66，B13等。進一步的驗證及這些siRNA預(yù)計靶基因的功能研究工作正在進行中。相向雙啟動子模式的siI

4、NA表達框是siRNA表達框方式上的新突破，我們構(gòu)建的基于HI／U6相向雙啟動子表達框的質(zhì)粒pBUH、pCUH、pEGUH具有優(yōu)于現(xiàn)有短發(fā)夾型siRNA表達載體的特性，如，連接效率高、穩(wěn)定、測序無障礙等，最重要的，用這類siRNA表達載體可以很簡便地構(gòu)建各種siRNA文庫。我們成功構(gòu)建了5lO7的隨機siRNA文庫，是這一類型的siRNA文庫的首次報道。用這一文庫進行的增殖基因篩選工作己初步顯示了這種文庫在基因功能研究中的良好應(yīng)用潛能。