mTOR特異性siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、研究目的:
　　構(gòu)建并篩選可表達(dá) mTOR基因特異性 siRNA的慢病毒,并在此基礎(chǔ)上采用巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子聯(lián)合重組酶表達(dá)基因構(gòu)建可在巨噬細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)siRNA的慢病毒表達(dá)載體,為后續(xù)體內(nèi)外研究其抗 Mtb感染的效果及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.根據(jù) mTOR基因的 mRNA序列選擇3條靶序列,根據(jù)每條靶序列按siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的 shRNA,同時(shí)根據(jù)其中一條 shRNA序列設(shè)計(jì)一條長(zhǎng)度及堿基組

2、成與之完全一致,但堿基順序被隨機(jī)打亂的序列作為對(duì)照 shRNA序列。針對(duì)每條 shRNA各設(shè)計(jì)一對(duì)單鏈寡聚脫氧核苷酸,經(jīng)緩慢退火后形成可表達(dá)相應(yīng) shRNA的雙鏈 DNA,通過(guò)限制性內(nèi)切酶 HpaⅠ和 XhoⅠ克隆入慢病毒表達(dá)框架質(zhì)粒 pSicoR中,獲取 pSicoR-mTOR干擾質(zhì)粒并命名為 pSM系列載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α后,篩選陽(yáng)性克隆、提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行 DNA測(cè)序。
　　2.將重組慢病毒表達(dá)載體(pS

3、M系列質(zhì)粒)、慢病毒包裝質(zhì)粒 psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒 pMD2.G按照一定比例混合共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集含有慢病毒顆粒的上清液,超濾離心,濃縮病毒顆粒。將慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞,利用逐孔稀釋法在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光表達(dá)情況,并計(jì)算病毒的滴度。采用適當(dāng)?shù)味鹊穆《绢w粒感染小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7,48h后,觀察慢病毒顆粒感染RAW264.7細(xì)胞的情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和 Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)m

4、TOR基因表達(dá)的變化。
　　3.利用 PCR技術(shù)從質(zhì)粒 Cre-Amp中擴(kuò)增出重組酶表達(dá)基因 Cre,克隆至質(zhì)粒 pBudCE4.1-SP146的 Hind III/Xba I位點(diǎn)中,獲得重組質(zhì)粒 pBudCE4.1-SP146-Cre,酶切鑒定正確后送測(cè)序。
　　4.采用 PCR技術(shù)分別擴(kuò)增獲取 SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及 pSico的3783至7566片段,然后利用 In-Fusion克隆技

5、術(shù)將 SP146-Cre克隆至 pSico中。將重組載體 pSico-SP146-Cre轉(zhuǎn)化大腸桿菌后選取陽(yáng)性克隆菌,采用菌落 PCR方法進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定,鑒定成功后送測(cè)序驗(yàn)證。
　　5.將 SP146啟動(dòng)子調(diào)控的質(zhì)粒 pSico-SP146-Cre分別轉(zhuǎn)染293T、RAW264.7細(xì)胞,通過(guò) SP146啟動(dòng)子調(diào)控 Cre/LoxP系統(tǒng)情況下,通過(guò)綠色熒光的表達(dá)模式觀察評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的特異性以及 SP146調(diào)控下的 Cr

6、e/LoxP系統(tǒng)的功能。
　　研究結(jié)果:
　　1.酶切及測(cè)序的結(jié)果顯示,mTor特異性 siRNA表達(dá)序列及對(duì)照序列均正確插入到質(zhì)粒 pSicoR中,成功構(gòu)建了 mTOR基因特異性的 siRNA慢病毒表達(dá)載體pSM1, pSM2, pSM3及對(duì)照 siRNA表達(dá)載體 pSM4。
　　2.利用293T細(xì)胞包裝重組慢病毒表達(dá)載體 pSM1/2/3/4,生產(chǎn)出慢病毒顆粒后進(jìn)行病毒濃縮,經(jīng)病毒滴度測(cè)定,四組慢病毒 lenti-

7、pSM1/2/3/4的滴度分別是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四種重組慢病毒顆粒感染 RAW264.7細(xì)胞,48h后均可觀察到明亮的綠色熒光,表明重組慢病毒能有效感染 RAW264.7細(xì)胞。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR及 Western blot檢測(cè)的結(jié)果相一致,均證實(shí)了lenti-pSM1組、lenti-pSM2組、lenti-pSM3組的 mTOR mRNA及蛋白

8、表達(dá)均受到抑制,其 mTOR mRNA表達(dá)水平的抑制率分別是24.1％、59.3%、41.1%,蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組(0.9567±0.021)及 lenti-pSM4組(0.9200±0.030)相比三實(shí)驗(yàn)組的灰度值分別為:0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032,其中l(wèi)enti-pSM2組為最佳干擾效果組。
　　4.菌落 PCR及測(cè)序結(jié)果證實(shí),MФ特異性啟動(dòng)子序列 SP146及 Cre基因片

9、段已成功插入質(zhì)粒 pSico中,成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體 pSico-SP146-Cre。將該重組載體及轉(zhuǎn)染入293T及 RAW264.7細(xì)胞,觀察到其在293T細(xì)胞中有很強(qiáng)的綠色熒光,但是在 RAW264.7細(xì)胞中幾乎沒(méi)有綠色熒光。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了針對(duì) mTOR基因干擾序列的系列慢病毒表達(dá)載體 pSM。
　　2.完成了慢病毒的包裝和濃縮,成功地利用構(gòu)建的重組慢病毒載體生產(chǎn)的慢病毒顆粒感染了 RAW26