2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建針對(duì)新型隱球菌cap10基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入新型隱球菌中,評(píng)價(jià)siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒對(duì)新型隱球菌(Cryptococcus neoformans,CN)莢膜相關(guān)蛋白(capsule associated protein,CAP)基因cap10表達(dá)的抑制效應(yīng),為新型隱球菌感染的治療奠定基礎(chǔ)。 方法:以cap10基因?yàn)榘谢颍鶕?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的cap10基因核苷酸序列,按照干擾模板設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用

2、網(wǎng)絡(luò)在線軟件確定一個(gè)針對(duì)cap10 mRNA的RNAi(RNAinteference,RNAi)靶點(diǎn),設(shè)計(jì)1對(duì)可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列,將其復(fù)性后插入載體質(zhì)粒psilencer4.1-CMV neo,構(gòu)建重組體。用LiAc化學(xué)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新型隱球菌細(xì)胞,確定G418篩選的濃度并篩選成功轉(zhuǎn)染的陽性菌株。構(gòu)建cap10基因表達(dá)熒光定量PCR檢測體系:比對(duì)新型隱球菌5種血清型(A、B、C、D、AD)的cap10基因序列,找出同源序列來設(shè)

3、計(jì)引物和探針,并將其PCR擴(kuò)增基因片段克隆到pGEM-T Easy載體上,構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;建立FQ-PCR體系,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn);將各組新型隱球菌培養(yǎng)后抽提總RNA,利用熒光定量檢測體系分別測定各實(shí)驗(yàn)組cap10基因的表達(dá)情況。取培養(yǎng)后的新型隱球菌與巨噬細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株J774A.1進(jìn)行共孵育,經(jīng)過PBS沖洗和甲醇固定,用吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,在顯微鏡下觀察,計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。用SPSS13.

4、0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: 1.靶向cap10基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒的測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致; 2.抽提新型隱球菌陽性克隆中的質(zhì)粒,序列測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相同。 3.cap10基因表達(dá)的熒光定量檢測體系檢測敏感度為104copies/μl,線性范圍為104~1010 copies/μl,批內(nèi)CV為0.31%,批間CV為2.73%。 4.pS4.1-siRC-1轉(zhuǎn)染干擾組新型

5、隱球菌的cap10基因表達(dá)平均拷貝數(shù)為175534.62copies/μl,明顯低于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組(321995.52copies/μl)和空白實(shí)驗(yàn)組(562931.66copies/μl)(均P<0.05),平均抑制率為30.58%。 5.新型隱球菌與巨噬細(xì)胞株J774A.1共孵育后,pS4.1-siRC-1轉(zhuǎn)染干擾組平均吞噬指數(shù)為0.128971212,吞噬率為10.06%,明顯均高于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組(0.078898104,6.57

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