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文檔簡介
1、目的:構建針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和趨化因子受體4(CXCR4)慢病毒介導的RNA干擾載體,通過體外實驗和體內(nèi)實驗觀察卵巢癌細胞VEGF和CXCR4表達受抑制后對癌細胞增殖和侵襲轉移情況的影響,部分闡明VEGF/CXCR4基因表達被抑制后對卵巢癌的發(fā)生與進展的影響,為針對VEGF/CXCR4基因的RNA干擾技術的臨床應用奠定基礎。 方法:(1)將VEGF基因mRNA和CXCR4基因mRNA作為RNA干擾的靶區(qū),通過E-R
2、NAi網(wǎng)上提供的在線服務,設計多個特異的RNA干擾序列,將其裝入含U6和H1啟動子的慢病毒載體FIV-based Lentivector Expression System上,構建成抑制VEGF和CXCR4基因表達的RNA干擾(siRNA)表達載體。(2)體外實驗中,將上述載體轉染人卵巢癌細胞株sw626,通過Real time PCR和Western blot觀察干擾載體對VEGF和CXCR4表達的抑制效果;通過CCK8檢測對腫瘤細胞
3、增殖的影響;通過重建基底膜實驗檢測細胞體外侵襲能力的變化。(3)體內(nèi)實驗中,將上述載體轉染細胞后注射裸鼠建立卵巢癌模型;通過檢測成瘤率、成瘤時間、瘤體大小、繪制生長曲線,觀察靶基因表達受抑制后,腫瘤增長的變化。腫瘤組織通過檢測CD34表達對MVD進行比較,同時采用TUNEL檢測腫瘤組織凋亡的變化。 結果:(1)成功構建了抗VEGF和CXCR4的siRNA慢病毒表達載體系統(tǒng),測序證實序列正確。(2)體外實驗中,通過Real tim
4、e PCR和Western blot,在人卵巢癌細胞株sw626中,VEGF和CXCR4慢病毒表達載體能明顯抑制靶基因的表達;CCK8顯示,當VEGF受抑制后,腫瘤細胞增殖受抑;重建基底膜實驗證實CXCR4表達受抑后細胞體外侵襲能力顯著降低。(3)體內(nèi)實驗中,VEGF和CXCR4被抑制后可減緩瘤體增長,腫瘤組織MVD下降,細胞凋亡增加。 結論:(1)針對VEGF和CXCR4基因的siRNA慢病毒表達載體能夠顯著抑制靶基因的表達(
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