視神經(jīng)NgR mRNA的表達(dá)及其siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建.pdf

1、視神經(jīng)損傷是臨床常見的眼外傷，迄今仍缺乏有效的治療手段。目前的研究證實(shí)：視神經(jīng)再生失敗的原因除了與其自身再生潛力低下，損傷后營養(yǎng)因子的缺乏，膠質(zhì)瘢痕的形成等有關(guān)外，其所處的微環(huán)境中存在著神經(jīng)生長抑制因子也是一個重要因素。2002年研究發(fā)現(xiàn)：少突膠質(zhì)細(xì)胞及其所形成的髓鞘中存在著的抑制蛋白——Nogo-66、MAG、OMgp，均通過NgR發(fā)揮作用，針對NgR的單克隆抗體可有效地促進(jìn)中樞神經(jīng)元軸突再生。NgR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，灰質(zhì)中含

2、量較高，大腦皮層、海馬、背側(cè)丘腦、小腦顆粒細(xì)胞等都有分布，但是，視神經(jīng)作為一種特殊的中樞神經(jīng)，其中是否存在NgR的表達(dá)尚未見報道，同時，能否利用RNA干擾技術(shù)來抑制NgR基因表達(dá)，繼而阻斷幾種抑制因子(Nogo-66、MAG、OMgp)的作用，進(jìn)而促進(jìn)視神經(jīng)再生修復(fù)也未見報道。 本實(shí)驗(yàn)的目的：檢測NgRmRNA在視神經(jīng)的表達(dá)情況，觀察視神經(jīng)損傷后NgRmRNA的表達(dá)變化，構(gòu)建NgRmRNA特異的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步通過R

3、NA干擾途徑來抑制NgR基因表達(dá)，促進(jìn)視神經(jīng)再生研究奠定基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)分為3個部分：(一).使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針通過原位雜交方法檢測視神經(jīng)中NgRmRNA的表達(dá)情況；(二).采用熒光定量PCR方法檢測視神經(jīng)損傷后NgRmRNA的表達(dá)變化；(三).構(gòu)建NgRmRNA的siRNA表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)果：1.原位雜交證實(shí)視神經(jīng)NgRmRNA表達(dá)陽性，對照實(shí)驗(yàn)呈陰性反應(yīng)；2.熒光定量PCR顯示視神經(jīng)損傷后NgRmRNA表達(dá)

4、無顯著性變化(P＞0.05)；3.成功的構(gòu)建了兩個NgR特異的RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論：視神經(jīng)存在NgRmRNA表達(dá)，提示NgR介導(dǎo)的抑制途徑可能是視神經(jīng)損傷后難以再生的一個原因；視神經(jīng)鉗夾傷后NgRmRNA表達(dá)無顯著性變化，而我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示視神經(jīng)鉗夾傷后Nogo-AmRNA的表達(dá)增高，配體和受體表達(dá)的不一致性，提示了Nogo-A除了抑制再生外，可能還有其它尚未闡明的功能，較之阻斷Nogo-A而言，