靶向SMAD3基因的siRNA篩選及其慢病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）和激活素A（ACTIVIN A），均為多功能的細胞因子，兩者的信號途徑及相關(guān)功能也是近年來的研究熱點。以往的研究表明，TGF-β/ACTIVIN A與細胞的增殖、分化、遷移及凋亡有關(guān)，在機體中參與了從炎癥反應、組織修復到胚胎發(fā)育等一系列重要的生物學過程，并與某些人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。特別是在肝臟中，該信號通路的異常與肝炎、肝纖維化、肝硬化肝癌以及肝再生

2、都有密切關(guān)系。因此對于該通路的研究具有十分重要的生物學意義，而對其各組分相互作用蛋白的研究將是闡明其功能及調(diào)控機制的關(guān)鍵所在。本研究旨在構(gòu)建以TGF-β/ACTIVIN A下游蛋白SMAD3為靶點的短發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA）慢病毒表達載體，為進一步探索肝再生機制提供有力工具。目的：為研究阻斷SMAD3信號傳導、抑制肝細胞凋亡和促進肝細胞再生，篩選出針對大鼠SMAD3基因的siRNA片段后，構(gòu)建靶向SMA

3、D3基因的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒，產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄大鼠SMAD3 shRNA的慢病毒，并感染大鼠正常肝細胞BRL-3A。方法：根據(jù)SMAD3基因設計并合成6對siRNA，轉(zhuǎn)染大鼠正常肝細胞株BRL-3A，抽取總蛋白用’western blotting方法篩選干擾效率較高的1對siRNA。根據(jù)篩選的siRNA設計并合成可表達shRNA的ssDNA，經(jīng)退火制備相應dsDNA，連接入經(jīng)XhoI和HpaI雙酶切線性化的慢病毒載體質(zhì)粒pll3.7載體

4、，經(jīng)酶切鑒定，陽性克隆測序，質(zhì)粒抽提，與慢病毒包裝質(zhì)粒PRRE，PREV，VSVG四質(zhì)粒由CaCl2導入人胚腎細胞株293FT生成慢病毒。收集包含有病毒的上清，感染靶細胞，熒光顯微鏡觀察細胞熒光。結(jié)果：根據(jù)wb結(jié)果分析，成功篩選出一條具有較高效率靶向SMAD3基因的siRNA。經(jīng)酶切、測序分析證實目的序列成功連接到載體上，載體構(gòu)建成功，包裝成功。成功感染BRL-3A細胞。結(jié)論：成功構(gòu)建并篩選了攜帶有大鼠SMAD3基因的RNAi慢病毒載體