靶向SMAD3基因的siRNA篩選及其慢病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）和激活素A（ACTIVIN A），均為多功能的細(xì)胞因子，兩者的信號途徑及相關(guān)功能也是近年來的研究熱點(diǎn)。以往的研究表明，TGF-β/ACTIVIN A與細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡有關(guān)，在機(jī)體中參與了從炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)到胚胎發(fā)育等一系列重要的生物學(xué)過程，并與某些人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。特別是在肝臟中，該信號通路的異常與肝炎、肝纖維化、肝硬化肝癌以及肝再生

2、都有密切關(guān)系。因此對于該通路的研究具有十分重要的生物學(xué)意義，而對其各組分相互作用蛋白的研究將是闡明其功能及調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵所在。本研究旨在構(gòu)建以TGF-β/ACTIVIN A下游蛋白SMAD3為靶點(diǎn)的短發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA）慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步探索肝再生機(jī)制提供有力工具。目的：為研究阻斷SMAD3信號傳導(dǎo)、抑制肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞再生，篩選出針對大鼠SMAD3基因的siRNA片段后，構(gòu)建靶向SMA

3、D3基因的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒，產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄大鼠SMAD3 shRNA的慢病毒，并感染大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A。方法：根據(jù)SMAD3基因設(shè)計(jì)并合成6對siRNA，轉(zhuǎn)染大鼠正常肝細(xì)胞株BRL-3A，抽取總蛋白用’western blotting方法篩選干擾效率較高的1對siRNA。根據(jù)篩選的siRNA設(shè)計(jì)并合成可表達(dá)shRNA的ssDNA，經(jīng)退火制備相應(yīng)dsDNA，連接入經(jīng)XhoI和HpaI雙酶切線性化的慢病毒載體質(zhì)粒pll3.7載體

4、，經(jīng)酶切鑒定，陽性克隆測序，質(zhì)粒抽提，與慢病毒包裝質(zhì)粒PRRE，PREV，VSVG四質(zhì)粒由CaCl2導(dǎo)入人胚腎細(xì)胞株293FT生成慢病毒。收集包含有病毒的上清，感染靶細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。結(jié)果：根據(jù)wb結(jié)果分析，成功篩選出一條具有較高效率靶向SMAD3基因的siRNA。經(jīng)酶切、測序分析證實(shí)目的序列成功連接到載體上，載體構(gòu)建成功，包裝成功。成功感染BRL-3A細(xì)胞。結(jié)論：成功構(gòu)建并篩選了攜帶有大鼠SMAD3基因的RNAi慢病毒載體