Treg-Th17細(xì)胞對(duì)結(jié)核的診斷價(jià)值及高通量檢測(cè)結(jié)核免疫分子譜的應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種傳染性疾病。目前結(jié)核病的疫情仍然十分嚴(yán)峻，早期、快速診斷對(duì)于結(jié)核病的治療和控制傳播都有極其重要的意義。機(jī)體抵抗結(jié)核桿菌的免疫機(jī)制主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫，因此結(jié)核病的診斷也主要從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面入手。體液免疫診斷主要是檢測(cè)患者體液中結(jié)核桿菌抗原、抗體以及免疫過(guò)程中產(chǎn)生的各種免疫分子;而細(xì)胞免疫診斷則是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞

2、免疫功能進(jìn)行疾病的診斷，它包括T細(xì)胞的數(shù)量、功能及其產(chǎn)物如細(xì)胞因子等的檢測(cè)。目前結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有痰涂片抗酸染色法、細(xì)菌培養(yǎng)法、結(jié)核桿菌PCR擴(kuò)增法以及γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)等。其中痰涂片檢查陽(yáng)性率低;痰培養(yǎng)需時(shí)又太長(zhǎng);PCR擴(kuò)增法技術(shù)要求較高;IGRAs可一定程度上彌補(bǔ)上述不足，具有較高的靈敏度和特異性，但仍不能滿足臨床需要，不能區(qū)分結(jié)核潛伏期、活動(dòng)期，對(duì)結(jié)核病不同病程的診斷也十分困難。由于不同結(jié)核感染人群存在不同免疫分

3、子譜，采用高通量檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫的多個(gè)結(jié)核免疫標(biāo)志物，可有效提升結(jié)核診斷陽(yáng)性率，并有可能通過(guò)對(duì)結(jié)核病不同病程時(shí)免疫分子譜的表達(dá)研究，了解結(jié)核桿菌感染活動(dòng)期、潛伏感染期的抗原結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)新的診斷分子標(biāo)志物。
　　目的：
　　本研究旨在通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)結(jié)核感染后不同病程患者體內(nèi)細(xì)胞免疫中起重要作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cell，Treg)和

4、TH17細(xì)胞，構(gòu)建以液態(tài)芯片技術(shù)(Luminex)為平臺(tái)的多種結(jié)核免疫分子（EGF、FGF-2、Eotaxin、TGF-α、G-CSF、Fit-3L、GM-CSF、Fractalkine、IFN-α2、IFNγ、GRO、IL-10、 MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、IL-13、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、

5、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、VEGF)同時(shí)檢測(cè)的高通量檢測(cè)技術(shù)，并分析不同病程結(jié)核免疫分子譜表達(dá)情況，確定結(jié)核病的不同感染階段特有的生物學(xué)標(biāo)志物，為臨床對(duì)結(jié)核患者的診斷、免疫功能和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.分別采集結(jié)核感染活動(dòng)期（66例）、潛伏感染期（57例）以及健康對(duì)照人群(58例)外周靜脈抗凝全血，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同階段患者外周血中

6、Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)ELISA法檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子IL-10和IL-17的表達(dá)情況，分析這兩類T淋巴細(xì)胞亞群在結(jié)核病不同病程中的表達(dá)情況及用于區(qū)分結(jié)核感染不同病程的可能性。并用ROC曲線驗(yàn)證各指標(biāo)用于區(qū)分結(jié)核活動(dòng)性感染和潛伏性感染的診斷效益。
　　2.分別采集結(jié)核感染活動(dòng)期（50例）、潛伏感染期（49例）以及健康對(duì)照人群(50例)外周靜脈抗凝全血，通過(guò)液態(tài)芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)38種（EGF、FGF-2、Eot

7、axin、TGF-α、G-CSF、Fit-3L、GM-CSF、Fractalkine、IFN-α2、IFNγ、GRO、IL-10、MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、IL-13、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、VEGF

8、)與結(jié)核感染相關(guān)的免疫標(biāo)志物，分析結(jié)核桿菌感染不同狀態(tài)下免疫標(biāo)志物的表達(dá)情況，了解結(jié)核桿菌感染活動(dòng)期、潛伏感染期的抗原結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)情況，從而提高結(jié)核感染診斷的陽(yáng)性率和發(fā)現(xiàn)新的診斷分子標(biāo)志物。并用ROC曲線驗(yàn)證各指標(biāo)用于區(qū)分結(jié)核活動(dòng)性感染和潛伏性感染的診斷效益。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)核活動(dòng)期組Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例明顯高于結(jié)核潛伏期組和正常對(duì)照組（Treg細(xì)胞:9.61±2.26％ VS6.31±1.44％和9

9、.61±2.26％ VS4.16±1.01％ P＜0.05;Th17細(xì)胞:3.08±0.80％ VS1.31±0.50％和3.08±0.80％VS1.15±0.46％ P＜0.05），結(jié)核潛伏期組Treg細(xì)胞的比例明顯高于正常對(duì)照組(6.31±1.44％ VS4.16±1.01％P＜0.05)，但結(jié)核潛伏期組Th17細(xì)胞的比例和正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(1.31±0.50％ VS1.15±0.46％ P＞0.05)。結(jié)核活動(dòng)期組IL-1

10、0和IL-17的表達(dá)量明顯高于結(jié)核潛伏期組和正常對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)核潛伏期組IL-10的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，但結(jié)核潛伏期組IL-17的表達(dá)量和正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞用于區(qū)分結(jié)核潛伏期和活動(dòng)期的ROC曲線下面積分別為0.890和0.710。
　　2.通過(guò)對(duì)檢測(cè)的38種結(jié)核免疫標(biāo)志物的分析發(fā)現(xiàn)，Eotaxin、IL-1α、IP-10、MCP-1、IL-10和TNF

11、-α在結(jié)核感染患者和健康對(duì)照人群間表達(dá)有明顯差異(P＜0.05)，MCP-1和IL-1α在結(jié)核活動(dòng)期和潛伏期表達(dá)有明顯差異(P＜0.05)。MCP-1和IL-1α用于區(qū)分結(jié)核潛伏期和活動(dòng)期的ROC曲線下面積分別為0.905和0.825。
　　結(jié)論：
　　1.Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞以及Eotaxin、IL-1α、IP-10、MCP-1、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子在結(jié)核感染患者中的表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照人群(P＜0.0