Th17細胞在人脊柱結(jié)核中的作用機制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分、脊柱結(jié)核患者血液及病骨組織中Th17細胞及其表型特征
　　目的：探討脊柱結(jié)核患者病骨組織、外周血中是否存在Th17細胞，其相關(guān)細胞因子的變化，并探討其數(shù)量、表型及轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)的表達情況。
　　方法：收集10例行脊柱結(jié)核病灶清除、植骨減壓融合內(nèi)固定術(shù)配合抗結(jié)核藥物治療的患者入院時、術(shù)中及術(shù)后1周的血液標本，脊柱結(jié)核病骨及術(shù)中取自體髂骨植骨塊標本。病理組織切

2、片觀察結(jié)核病骨及術(shù)中取自體骨植骨塊組織形態(tài)學(xué)改變。流式細胞術(shù)及雙重免疫熒光染色確定標本中存在Th17細胞及其所占CD4+T細胞百分比，并確定其表型。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測標本中干擾素（IFN-γ）和腫瘤壞死因子（TNF-α）水平;PCR檢測標本中RORγtmRNA表達。
　　結(jié)果：(1)血液標本前后對照的變化入院時IFN-γ為168.7±19.2pg/L，術(shù)中IFN-γ為113.7±15.3pg/L，術(shù)后1周IFN-γ為

3、62.7±14.9pg/L;入院時TNF-α為37.1±8.4ng/mL，術(shù)中TNF-α為32.1±5.3ng/mL，術(shù)后TNF-α為0.2±7.4ng/mL。術(shù)前與術(shù)中比較明顯增高(P＜0.05)，術(shù)中與術(shù)后比較明顯增高(P＜0.05);(2)脊柱結(jié)核病骨及術(shù)中取自體髂骨植骨塊標本對照的變化病骨組織中IFN-γ為78.7±32.4pg/L，自體髂骨植骨塊中IFN-γ為11.3±5.2pg/L;病骨組織中TNF-α為9.6±4.4ng/

4、mL，自體髂骨植骨塊中 TNF-α為7.5±4.3ng/mL，脊柱結(jié)核病骨中明顯高于自體髂骨植骨塊中濃度(P＜0.05);(3)骨組織中與血液中IFN-γ及TNF-α水平比較脊柱結(jié)核病骨組織中較入院時及術(shù)中、術(shù)后血液中濃度增高(P＜0.05)，術(shù)中取自體髂骨植骨塊中濃度較術(shù)前及術(shù)中血液中濃度減低(P＜0.05)，與術(shù)后1周無明顯差異(P＞0.05);(4) Th17細胞比例、RORγt和IL-17 mRNA表達量改變術(shù)前血液Th17細胞

5、占CD4+T淋巴細胞比例為0.8％±0.1％，術(shù)中為0.9％±0.2％，術(shù)后1周為0.4％±0.1％，術(shù)前與術(shù)中比較明顯增高(P＜0.05)，術(shù)中與術(shù)后比較明顯增高(P＜0.05)。;脊柱結(jié)核病骨中Th17細胞比例為:8.2％±3.2％，自體髂骨植骨塊中Th17細胞比例為:0.2％±0.1％。脊柱結(jié)核病骨中明顯高于自體髂骨植骨塊中濃度(P＜0.05)。術(shù)前血液中RORγt表達量為(23.4±3.6)ng/L，結(jié)核病骨組織中RORγt表達

6、量為(56.3±4.4)ng/L，自體髂骨植骨塊中RORγt表達量為(2.1±0.2)ng/L，結(jié)核病骨組織中濃度高于血液中及自體髂骨植骨塊中濃度(P＜0.05);(5)Th17細胞表型脊柱結(jié)核病骨中Th17細胞表達CD45RO表型特征比例為87.4％±6.8％，表達CD45RA為5.9％±1.8％，比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);血液中Th17細胞表達CD45RO表型特征比例為69.3％±5.4％，表達CD45RA為4.3％±2.0

7、％，比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：脊柱結(jié)核病骨及血液中存在Th17細胞，且在脊柱結(jié)核病骨中濃度升高，其表型特征為記憶性T淋巴細胞。
　　第二部分、Thl7細胞在人脊柱結(jié)核血液及病骨組織中上調(diào)的相關(guān)研究
　　目的：探討上調(diào)Th17細胞作用的細胞因子及趨化因子種類,探討Th17的來源。
　　方法：收集10例行脊柱結(jié)核病灶清除、植骨減壓融合內(nèi)固定術(shù)配合抗結(jié)核藥物治療的患者入院時、術(shù)中及術(shù)后1周的血液標本

8、,脊柱結(jié)核病骨及術(shù)中取自體髂骨植骨塊標本。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測標本中IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-23及TGF-α濃度；制備純化后的原始CD4+T淋巴細胞后與IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-β單獨或混合培養(yǎng)后計數(shù)Th17細胞比例變化；以ELISA法檢測成骨細胞表達CCL20、CCL22、CCL27濃度,免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細胞表達CCL20、CCL22、CCL27形態(tài)；觀察Th17趨化指

9、數(shù)變化。流式細胞術(shù)觀察結(jié)核病骨及血液中Th17細胞表達CCR受體及CCL配體的關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)、脊柱結(jié)核組入院前血液中IL-1β為1437.0±73.0pg/L,術(shù)中為1167.0±81.6pg/L,術(shù)后1周血液中IL-1β為761.3±57.8pg/L；脊柱結(jié)核組入院前血液中IL-6為784.1±87.7pg/L,術(shù)中為693.5±85.7pg/L,術(shù)后1周為217.8±97.5pg/L；脊柱結(jié)核組入院前血液中IL-23

10、為258.4±64.7pg/L術(shù)中為254.2±54.1pg/L,術(shù)后1周為126.6±92.4pg/；脊柱結(jié)核組入院前血液中CCL20為31.3±2.5pg/,術(shù)中為54.2±7.1pg/,術(shù)后1周為26.5±9.9Pg/L；脊柱結(jié)核病骨中CCL20為831.3±2.5pg/L，CCL22為947.1±7.1pg/L，CCL27為932.8±5.2Pg/L；自體髂骨塊中CCL20為16.1±2.4pg/CCL22為12.5±0.4pg

11、/,CCL27為132.8±5.2pg/；IL-6、IL-23及TGF-p濃度均明顯升高(P0.01)。結(jié)核組中Th17細胞比例與IFN-y-IL-1p、 IL6、IL-23及TGF-p濃度之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.05)。結(jié)核病骨中的配體趨化因子CCL20、CCL22和CCL27顯著高于血液中的濃度及術(shù)中取自體髂骨塊中的濃度(P0.05)。(2)、脊柱結(jié)核病骨Th17細胞表面表達CCR4的細胞比例為：67.3%±2.3%,CCR6

12、為：72.4%±4.1%,CCR10為：56.8%±2.3%,而CCR2為：2.4%±0.3%、CCR3為：21.5%±4.6%,CCR5為3.7%±0.5%。術(shù)前血液中Th17細胞表面表達CCR4的細胞比例為：54.3%±6.2%,CCR6為：69.3%±6.2%,CCR10為：52.5%±7.1%,而CCR2為：3.8%±1.5%、CCR3為：24.1%±6.8%,CCR5為2.2%±1.4%。結(jié)核病骨中的Th17細胞趨化因子受體表

13、達顯著高于血液中(P0.05)。(3)、Th17趨化指數(shù)變化單獨加入α-CCL20后Th17細胞及成骨細胞趨化性均減弱,共同加入α-CCL20、 α-CCL22和α-CCL27后Th17細胞趨化指數(shù)下降最為明顯。
　　結(jié)論：結(jié)核病骨組織及血液中趨化因子受體及配體在炎性因子作用下上調(diào),其中IL-6、IL-1β、TNF-α上調(diào)Th17細胞分化,而IFN-γ抑制Th17上調(diào)。脊柱結(jié)核病骨中Th17細胞的來源包括兩方面：1,自身局部組織T

14、h17細胞的分化增殖；2,在CCL20-CCR6趨化軸、CCL22-CCR4和CCL27-CCR10趨化軸的作用及成骨細胞自身趨化作用下,將Th17細胞自血液中募集至病骨組織中。
　　第三部分、人脊柱結(jié)核病骨中成骨細胞抗原遞呈性及其免疫調(diào)節(jié)功能的相關(guān)研究
　　目的：探討脊柱結(jié)核患者病骨中Th17細胞對成骨細胞增殖的影響及成骨細胞對Th17細胞的抗原遞呈性。
　　方法：10例脊柱結(jié)核患者為實驗組,采用改良酶消化法獲取脊柱

15、結(jié)核病骨中的成骨細胞后培養(yǎng),待成骨細胞于培養(yǎng)皿融合平鋪后以移液管于中部畫出等距離間隙制作成骨細胞損傷模型,將IL-17、IL-22、IFN-γ及其對應(yīng)抗體分別與損傷模型共培養(yǎng),觀察不同時間點成骨細胞融合情況。成骨細胞予堿性磷酸酶試驗及茜素紅試驗鑒定；流式細胞技術(shù)檢測脊柱結(jié)核病骨成骨細胞及術(shù)中取自體髂骨塊成骨細胞表面HLA-DR、CD80和CD86,將血液中純化的CD4+T淋巴細胞在有或無結(jié)核抗原85B情況下與IL-17、IL-22、成骨

16、細胞、IFN-γ以及抗CD80、CD86單克隆抗體組合混合培養(yǎng),檢測T細胞增殖標記細胞Ki-67+CD4+T細胞數(shù)量及Th17數(shù)量。
　　結(jié)果：(1)、在結(jié)核病骨中分離出的成骨細胞表達IL-22R比例為59.6%±4.6%、IL-17R為68.9%±7.2%、IFN-Y R為51.9%±5.9%；(2)、IL-22、IL-17促進成骨細胞增殖及活力,而IFN-γ抑制成骨細胞及活力。anti-IL-22、anti-IL-17抑制成骨

17、細胞增殖,而anti-IFN-γ促進成骨細胞增殖；(3)、從結(jié)核病骨中分離出來的成骨細胞表達HLA-DR的比例為90.4%±3.9%,表達CD80為87.3%±4.1%,表達CD86為93.2%±7.2%,在有結(jié)核桿菌特異性抗原85B存在的條件下,Ki-67+CD4+T細胞顯著降低,結(jié)核病骨單細胞懸液中Ki-67+CD4+T細胞(有成骨細胞條件下)明顯增高；(4)、Th17細胞在有成骨細胞及85B存在時顯著增高,IL-17及IL-22、