脫細(xì)胞真皮基質(zhì)軟組織增量效果及轉(zhuǎn)歸的初步研究.pdf

1、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為近年來國(guó)內(nèi)外新興起的一種組織替代物，本課題組通過初步顆?；瑺蠲摷?xì)胞真皮基質(zhì)后，分別將顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉凝膠作為軟組織填充材料，在動(dòng)物體內(nèi)建立軟組織增量模型，探究顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的組織增量效果和轉(zhuǎn)歸機(jī)制，為進(jìn)一步細(xì)化顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)乃至制成注射型的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)打下基礎(chǔ)，以期為臨床提供更理想的軟組織填充材料。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)將顆粒狀脫細(xì)胞

2、真皮基質(zhì)、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉凝膠作為軟組織填充材料，通過在動(dòng)物體內(nèi)建立軟組織增量模型，從組織增量的體積和高度來初步探究3種不同材料的組織增量效果;初步研究填充材料的轉(zhuǎn)歸機(jī)制;以探討進(jìn)一步細(xì)化顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)乃至制成注射型的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的可行性。
　　方法:
　　1.在兔耳上分別注射透明質(zhì)酸鈉凝膠0.05 ml、0.10 ml、0.15 ml，每組6個(gè)樣本，用三維輪廓掃描儀掃描建模后測(cè)量注射區(qū)軟組織增量的體積

3、;在-20℃環(huán)境中使用OCT包埋劑包埋標(biāo)本，切片直至達(dá)到兔耳注射區(qū)最高點(diǎn)，并在注射區(qū)的矢狀剖面上使用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄注射區(qū)域組織的高度。
　　2.大小約1.0 cm×1.0 cm×1mm的片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（海奧口腔修復(fù)膜）修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的顆粒狀，在兔耳移植區(qū)域作一長(zhǎng)約1.0 cm的橫行切口，在兔耳表皮與軟骨之間潛行分離出一個(gè)大小約為1.0 cm×1.0cm的皮下袋，在兔耳上移植經(jīng)生理鹽水液化的顆粒狀脫細(xì)胞

4、真皮基質(zhì)、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，記錄為顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和片狀脫細(xì)胞組真皮基質(zhì)組，分別在移植后1周、2周、1月、3月、6月、9月收獲標(biāo)本，每組每個(gè)時(shí)間段6個(gè)樣本;在兔耳上注射透明質(zhì)酸鈉凝膠（潤(rùn)百顏）0.10 ml，記錄為透明質(zhì)酸鈉凝膠組，在術(shù)后的1周、2周、1月、3月、6月收獲標(biāo)本，透明質(zhì)酸鈉凝膠組每個(gè)時(shí)間段6個(gè)樣本;在6只兔耳中選擇6個(gè)空白區(qū)域，作為空白組。3個(gè)處理組的所有兔耳標(biāo)本采用三維輪廓掃描儀掃描建模后測(cè)量移植區(qū)軟組織增量的體

5、積。3個(gè)處理組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇4個(gè)標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，進(jìn)行三維重建后測(cè)量移植區(qū)軟組織增量的體積。使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件比較分析不同處理組（顆粒狀脫細(xì)胞真皮組、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和透明質(zhì)酸鈉凝膠組）在移植后不同時(shí)間段移植區(qū)域軟組織增量體積。
　　結(jié)果:
　　注射量0.05 ml、0.10 ml、0.15 ml的樣本軟組織增量體積分別為(57.277±9.772) mm3、(106.785±10.568)

6、 mm3、(129.686±28.896) mm3,3組注射區(qū)域的組織增量分別與各自的注射量體積相互比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128＞0.05;P=0.177＞0.05;P=0.146＞0.05)。移植區(qū)域組織高度分別為(2.300±0.182)mm、（2.797±0.279)mm、(2.890±0.411) mm。0.05 ml組的組織高度低于0.10 ml組和0.15 ml組(P=0.001＜0.05;P=0.000＜0.0

7、5)，注射量由0.05 ml增加到0.10 ml時(shí)，組織高度隨注射量的增加而增加;0.10 ml組與0.15 ml組相互比較，顯示組織增量的高度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.441＞0.05)，提示注射量由0.10 ml增加到0.15 ml時(shí)，組織增量高度并沒有發(fā)生明顯變化。
　　顆粒狀、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和透明質(zhì)酸鈉凝膠組在各個(gè)時(shí)間段的兔耳移植術(shù)區(qū)均未見明顯感染、壞死，各個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后一般情況良好，飲食、排便等活動(dòng)正常，未見明顯不

8、適。顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植組、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植組在術(shù)后9月移植區(qū)域軟組織增量效果不明顯，三維輪廓掃描儀和Micro-CT掃描儀無法獲得該區(qū)域軟組織增量。
　　HE染色后在移植后的1周和2周，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和透明質(zhì)酸鈉凝膠組中大量的紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有功能活躍的成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入移植區(qū)域內(nèi)。在移植后期顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組中原有的填充材料隨著時(shí)間逐漸吸收完全，移植區(qū)域組織改

9、建成與宿主周圍組織一致的結(jié)構(gòu)。在透明質(zhì)酸鈉凝膠組中，填充材料和新生的纖維形成暫時(shí)的支架，供細(xì)胞爬行生長(zhǎng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，支架結(jié)構(gòu)逐漸崩解。
　　Masson染色結(jié)果:顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉凝膠組在移植區(qū)域均可見新生纖維長(zhǎng)入，并且隨著移植時(shí)間的推移，纖維數(shù)量增加。在顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組中，新生的纖維主要是逐漸包繞、替代填充物，早期的纖維排列較為紊亂，后期纖維排列結(jié)構(gòu)整齊、致密;在

10、透明質(zhì)酸鈉凝膠組，新生的纖維長(zhǎng)入，形成支架供細(xì)胞爬行生長(zhǎng)，隨著時(shí)間推移，纖維支架結(jié)構(gòu)逐漸崩解。
　　天狼星紅染色后偏振光顯微鏡下，Ⅰ型膠原纖維呈紅色、橙黃色或黃色;Ⅲ型膠原纖維呈綠色，非膠原纖維處呈黑色。各個(gè)處理組切片視野中紅黃色面積與綠色面積隨著時(shí)間發(fā)生規(guī)律性變化。顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組，在移植術(shù)后的早期，綠色的Ⅲ型膠原纖維逐漸增多，Ⅲ型膠原纖維主要分布在填充材料的顆粒與顆粒之間，從微粒四周向中央長(zhǎng)入，隨后Ⅲ型膠原纖維開始減少，

11、紅色的Ⅰ型膠原纖維數(shù)量增多，在6月和9月時(shí)移植區(qū)域內(nèi)紅色的Ⅰ型膠原纖維為主要的膠原纖維，膠原纖維與兔耳周圍組織的纖維排列方式相似。在片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組，在移植術(shù)后的早期，綠色的Ⅲ型膠原纖維最開始主要分布于片狀填充材料的外周，在填充材料的兔耳移植區(qū)域剝離的基底面向表皮面長(zhǎng)入，隨著時(shí)間的推移，綠色的Ⅲ型膠原纖維逐漸被紅色的Ⅰ型膠原纖維所替代。透明質(zhì)酸鈉凝膠組，在早期，新生的綠色Ⅲ型膠原纖維形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，移植時(shí)間延長(zhǎng)，紅色的Ⅰ型膠原纖維從網(wǎng)

12、狀結(jié)構(gòu)的四周向中央逐漸增多，替代綠色的Ⅲ型膠原纖維。
　　Ⅰ/Ⅲ型膠原比例變化結(jié)果:3種填充材料Ⅰ/Ⅲ型膠原比例在移植術(shù)后呈先下降后上升的趨勢(shì)，在移植術(shù)后2周Ⅰ/Ⅲ型膠原比例出現(xiàn)了最低點(diǎn)，在6月和9月Ⅰ/Ⅲ型膠原比例基本趨于穩(wěn)定，與正常的兔耳組織Ⅰ/Ⅲ型膠原比例相接近。移植區(qū)域膠原亞型在不同時(shí)間的規(guī)律變化符合機(jī)體創(chuàng)傷愈合膠原變化過程。
　?、?Ⅲ型膠原比例比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果:在6月，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.455＞0.

13、05)，片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.688＞0.05)，透明質(zhì)酸鈉凝膠組(P=0.339＞0.05)，與空白組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在移植術(shù)后的9月，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.330＞0.05)，片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.148＞0.05)，與空白組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　移植區(qū)域組織高度結(jié)果:從總體上看，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和透明質(zhì)酸鈉凝膠組移植區(qū)域組織

14、高度呈遞減趨勢(shì)，在最初的1個(gè)月內(nèi)遞減速度較快，隨后高度變化趨緩，在6月、9月時(shí)組織高度逐漸與空白組接近。與移植區(qū)域組織增量體積不同，在經(jīng)歷了高度變化較大的移植早期（1個(gè)月）后，透明質(zhì)酸鈉凝膠組移植區(qū)域組織高度均值高于顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組和片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。在移植術(shù)后的6月，片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.056＞0.05)，與空白組兔耳軟骨上組織的厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在移植術(shù)后的9月，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.790＞0

15、.05)，片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組(P=0.776＞0.05)，與空白組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例比兔耳軟骨上組織的厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用兔耳作為注射型軟組織填充材料研究動(dòng)物模型時(shí)，0.05～0.10 ml是一個(gè)適當(dāng)?shù)淖⑸淞糠秶?br>　　2.顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉凝膠作為軟組織填充材料時(shí)，從移植區(qū)域組織的增量體積和高度來評(píng)價(jià)材料組織增量效果的顯著性和穩(wěn)定性時(shí)，3組材料均具有

16、良好的組織增量效果。片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)通過初步顆?；?，制作成大小約為1 mm×1 mm×1 mm的顆粒狀時(shí)，在移植術(shù)后的9個(gè)月內(nèi)，顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的組織增量效果能夠取得與片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植相似的增量效果;在移植術(shù)后組織增量體積的穩(wěn)定性方面優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉凝膠。進(jìn)一步細(xì)化顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)乃至制成注射型的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，以期制作出更為理想的填充材料具有一定的可行性。
　　3.顆粒狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、片狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為填充材