異種脫細胞真皮基質微粒皮膚的構建及其相關實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、深度缺損創(chuàng)面的修復在燒燙傷、難治性皮膚潰瘍、瘢痕整形等的治療中有著重要意義。傳統(tǒng)的治療方法主要是移植自體皮或自體皮瓣,常常會出現供皮區(qū)色素沉積,瘢痕形成。當皮膚缺損面積較大時,自體皮還會供應不足。皮膚組織工程(TE)的發(fā)展與應用為改善創(chuàng)面修復質量,解決皮源短缺問題,提供了一條嶄新的途徑。
  近年來,脫細胞真皮基質(ADM)成為組織工程皮膚研究中最有前景的真皮支架材料之一,ADM修復皮膚粘膜缺損和進行軟組織充填的有效性已經被動物實

2、驗和初期臨床應用實驗所證明,是一種較為理想的真皮替代物。由于同種異體ADM來源有限且受倫理限制,為此研究人員開發(fā)了豬的ADM。傳統(tǒng)方法制備的異種ADM,抗原性明顯強于同種異體ADM,移植后成活率降低且收縮明顯,組織學研究證實組織中有廣泛的炎癥反應及膠原結構破壞。目前,異種ADM的制備方法還缺乏統(tǒng)一標準,主要有高滲鹽水法、酶消化法、戊二醛交聯法、去垢劑法、NaOH消蝕法、凍融法等。每種方法單獨使用時都不能保證既充分去除所有的細胞和細胞碎片

3、,又保證真皮結構完整,必須與其他方法聯合應用方能獲得較理想的ADM支架材料。另一方面,ADM移植后的血管化及營養(yǎng)成分滲透等問題的解決,對提高ADM支架的實用性有著重要的臨床意義。
  本課題在現有ADM制備方法的基礎上,制備一種新型異種ADM微粒,并利用成纖維細胞能夠分泌多種細胞外基質、細胞因子和生長因子的特性,將成纖維細胞種植于異種ADM微粒上,探索構建ADM微粒皮膚的可行性;并將ADM微粒皮膚注射到SD大鼠皮下和移植到全層損傷

4、模型,觀察ADM微粒皮膚對軟組織和創(chuàng)傷的修復能力,期望能夠收獲一種應用方便,適用范圍廣的組織工程微粒皮膚產品,并為規(guī)?;?、商品化生產微粒皮膚奠定一個良好的基礎。
  本實驗的研究內容和結果如下:
  1.改良消蝕法制備異種脫細胞真皮基質微粒及其生物相容性評價
  應用機械法切除豬真皮乳頭層,結合胰酶消化、NaOH消蝕法和凍融法除去網狀真皮中的所有細胞,制備成ADM。將ADM切割成顆粒狀,對ADM微粒做細胞毒性實驗、細胞

5、相容性實驗、皮下埋藏實驗和免疫組化實驗檢驗其生物相容性。結果顯示ADM微粒大小較均勻呈瓷白色,有彈性,韌性好,質地柔軟;三維結構完整,膠原纖維稍松散但排列規(guī)則,相互交織成立體網狀結構,孔隙較多并均勻;成纖維細胞在ADM微粒上生長較好,在材料上有數層細胞生長;無明顯排異反應,組織相容性良好,血管和成纖維細胞長入快。
  2.異種ADM微粒皮膚的構建及其性能研究
  體外培養(yǎng)人成纖維細胞,用PKH26標記,將細胞與ADM微粒復合

6、構建微粒皮膚,用熒光顯微鏡觀察、電鏡觀察和MTT法檢測組織工程微粒皮膚的性能。結果顯示,種植第2天,成纖維細胞在ADM微粒上能夠較好黏附,但增殖緩慢,之后細胞增殖明顯加快,10天時達到增殖高峰。成纖維細胞能在ADM微粒上很好的生長,構建好的組織工程微粒皮膚上成纖維細胞呈多層生長,并分泌大量細胞外基質。
  3.異種ADM微粒皮膚皮下注射和SD大鼠全層皮膚損傷移植實驗
  將帶熒光的豬ADM微粒皮膚,注射到SD大鼠皮下,用熒光

7、顯微鏡和HE觀察ADM微粒真皮對皮下組織的修復;將SD大鼠隨機分成3組,分別移植自體全厚皮膚、ADM微粒和ADM微粒皮皮膚。大體、熒光顯微鏡和HE觀察傷口愈合情況、計算創(chuàng)面愈合時間和收縮率。結果顯示ADM微粒皮下注射后一周可觀察到紅色熒光,提示種植的成纖維細胞具有活性。皮下注射ADM微粒皮膚8周時體積穩(wěn)定,膠原排列整齊,成纖維細胞數目少并穩(wěn)定,而單純ADM微粒皮下注射12周時體積才穩(wěn)定。皮膚移植修復全層皮膚損傷模型見:ADM微粒皮膚移植

8、和ADM微粒移植相比,血管化加快,特別是移植早期;ADM微粒皮膚對創(chuàng)面的修復,其愈合時間與自體全厚皮膚移植相當(P﹥0.05),明顯好于單純ADM微粒移植(P﹤0.01);創(chuàng)面收縮情況,ADM微粒皮膚與自體全厚皮膚移植相比無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05),與ADM微粒移植相比,差異顯著(P﹤0.01)。
  綜上所述,我們所制備的豬ADM微粒是一種新型、免疫原性低、生物相容性好的真皮支架材料,用于構建微粒皮膚具有實際可行性。體內動物實

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