脂肪來源干細胞復(fù)合脫細胞真皮基質(zhì)微粒修復(fù)聲帶急性損傷的實驗研究.pdf

1、聲帶固有層細胞外基質(zhì)成分是聲帶正常振動的基礎(chǔ)，其損傷后固有層細胞外基質(zhì)的組成及分布發(fā)生變化，大量纖維組織增生，形成聲帶瘢痕，導致發(fā)音障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。臨床上，聲帶注射填充術(shù)在一定程度上能改善發(fā)音，但不能恢復(fù)聲帶固有層細胞外基質(zhì)的組成及分布，也就不能實現(xiàn)聲帶的結(jié)構(gòu)重建、功能恢復(fù)。近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展給聲帶損傷的修復(fù)重建帶來了希望。種子細胞和支架材料的選擇是目前研究的核心內(nèi)容，可能對促進聲帶損傷修復(fù)及功能恢復(fù)具有重大意義。

2、應(yīng)用胚胎干細胞或骨髓干細胞混合膠原注入受損的聲帶的研究取得了一定的進展，但存在倫理限制、細胞來源少及創(chuàng)傷大等問題，且膠原在聲帶內(nèi)易被吸收。脂肪來源干細胞(ASCs)體外易分離培養(yǎng)，來源豐富，取材簡便，創(chuàng)傷小。脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)是天然生物材料，在體內(nèi)可完全降解，對細胞和組織無毒性，是良好的細胞支架材料。
　　本實驗將兔脂肪來源干細胞與牛脫細胞真皮基質(zhì)微粒復(fù)合培養(yǎng)后注入急性損傷的兔聲帶，觀察其對損傷聲帶的修復(fù)重建效果。
　

3、　1、目的：
　　探討rASCs-MADM復(fù)合體用于聲帶注射的可行性及其對聲帶急性損傷的修復(fù)重建效果。
　　2、方法
　　2.1、取兔腹股溝脂肪組織，膠原酶消化，分離培養(yǎng)rASCs，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞生長規(guī)律，定向誘導培養(yǎng)鑒定細胞的多向分化潛能，并對細胞進行凍存復(fù)蘇培養(yǎng)。
　　2.2、無疫新鮮胎牛皮膚，機械方法去除表皮及真皮乳頭層，使用網(wǎng)狀層真皮，結(jié)合胰蛋白酶消化法-NaOH消蝕法-凍融法

4、，制成脫細胞真皮基質(zhì)，將其切割成微粒，直徑約200-450μm。取DiI標記好的rASCs與制備好的MADM復(fù)合培養(yǎng)，熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞黏附材料情況，MTS比色法檢測rASCs復(fù)合MADM后細胞增殖情況。復(fù)合體培養(yǎng)3天，與適量膠原混合后注入正常兔聲帶肌內(nèi)，術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體形態(tài)，并分別隨即取材，冰凍切片后立即在熒光顯微鏡下觀察rASCs在聲帶中存活、分布情況，HE染色觀察聲帶組織對材料的炎癥排斥反應(yīng)及材料降解

5、情況。
　　2.3、成年雄性新西蘭大白兔6只，體重2.7-3.2kg，隨機分為2組。麻醉后行喉裂開暴露雙側(cè)聲帶，半導體激光(功率8W)損傷雙側(cè)聲帶膜部后1/2組織，深達甲杓肌，術(shù)后2、4w內(nèi)窺鏡下觀察兔子雙側(cè)聲帶的大體形態(tài)，并隨即分別取材，HE染色觀察聲帶上皮覆蓋損傷部位及固有層組織結(jié)構(gòu)變化情況，VanGieson染色觀察固有層膠原排列變化。
　　2.4、新西蘭大白兔18只，體重約2.7-3.2kg，隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每

6、組6只。Ⅰ組左聲帶注射rASCs-MADM，Ⅱ組左聲帶注射rASCs，Ⅲ組左聲帶注射MADM，各組右聲帶僅單純損傷，另設(shè)3只兔子的聲帶為正常對照。聲帶急性損傷，隨即進行聲帶注射。聲帶注射術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶損傷修復(fù)情況，并于術(shù)后8w取材，HE染色觀察聲帶固有層組織結(jié)構(gòu)大體變化，VanGieson染色法觀察各組聲帶固有層膠原情況。
　　3、結(jié)果
　　3.1、rASCs體外易分離培養(yǎng)，取材料簡便，增殖能力強，在不同微

7、環(huán)境下可分化為脂肪細胞、成骨細胞和成肌細胞，凍存復(fù)蘇后的細胞仍能保持良好增殖能力。
　　3.2、MADM所含膠原連續(xù)性好，相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙約20-50μm，可切割成直徑200-450μm微粒，可行注射方式移植。rASCs能黏附材料上生長良好并不斷增殖，與常規(guī)培養(yǎng)組細胞增殖能力比較，有顯著差異。rASCs-MADM在兔聲帶內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)輕微，注入8w后，可觀察到有植入細胞存活和部分材料保留，說明材料生物相容性好，降解速

8、度適當，是一種良好的支架材料。
　　3.3、喉裂開方式進行聲帶損傷來建立聲帶急性損傷模型，損傷部位及程度明確，術(shù)后聲帶無明顯粘連，對動物頸部損傷不大，頸部無局部并發(fā)癥發(fā)生，整個操作程度簡單。切片發(fā)現(xiàn)：2w聲帶粘膜上皮已覆蓋損傷部位，固有層大量膠原沉積，未形成束狀，4w聲帶損傷部位不平整，固有層膠原沉積增生繼續(xù)增多，呈粗大束狀，排列紊亂。
　　3.4、聲帶急性損傷后即行聲帶注射，并于術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體情況，結(jié)

9、果顯示：注射rASCs-MADM組、rASCs組的聲帶損傷部位光滑，肉芽組織形成少，而注射MADM組聲帶、單純損傷組聲帶損傷部位表面不規(guī)則、肉芽組織形成多。HE染色、VanGieson染色法顯示，注射rASCs-MADM組、rASCs組聲帶固有層膠原排列連續(xù)有序，而注射MADM組膠原呈彎曲束狀緊密排列，單純損傷組膠原排列紊亂、斷裂，膠原大量沉積增生。
　　4、小結(jié)
　　4.1、rASCs來源豐富，取材簡便，體外易分離培養(yǎng)，增

10、殖能力強，能多向分化，應(yīng)用前景廣。
　　4.2、MADM制備簡便，強度適中，具有良好的三維結(jié)構(gòu)，生物相容性好,降解速度適當，是良好的細胞支架材料和聲帶注射填充材料。
　　4.3、通過喉裂開對動物聲帶損傷來建立聲帶損傷動物模型方法可行，對動物損傷不大，操作簡單。
　　4.4、rASCs能粘附MADM表面生長，而且MADM能明顯促進細胞增殖，形成rASCs-MADM復(fù)合體，可行聲帶內(nèi)注射。聲帶注入rASCs-MADM復(fù)合體