胚泡與子宮內(nèi)膜著床相關(guān)基因的篩選及其功能的研究.pdf

1、胚胎著床(又稱胚胎植入)是哺乳動(dòng)物和人類生殖生理特有的一個(gè)環(huán)節(jié)，也是關(guān)系到妊娠成功與否的關(guān)鍵步驟。著床的順利進(jìn)行有賴于胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育，即胚胎發(fā)育至胚泡階段并完成孵化過程，同時(shí)子宮也處于接受狀態(tài)，從而使得活化狀態(tài)的胚泡能在“著床窗口”極其有限的開放時(shí)間內(nèi)，及時(shí)與處于接受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜建立緊密聯(lián)系。這一顯得非常精致的協(xié)同發(fā)育過程受到來源于胚胎和母體子宮內(nèi)膜雙方的各種激素、生長因子、細(xì)胞因子、蛋白酶等激素類分子和非激素類分子的調(diào)控，

2、但其確切的分子機(jī)制仍不是十分清楚。 為了尋找新的與胚胎著床相關(guān)的非激素類分子，以更深入地了解胚胎著床的分子機(jī)制，并探尋進(jìn)行生殖調(diào)控的新環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)室以小鼠為動(dòng)物模型，分別收集了著床當(dāng)日(孕D5天)小鼠著床部位和非著床部位子宮組織，以及著床前(孕D4天)和著床當(dāng)日(孕D5天)小鼠胚泡，然后分別應(yīng)用cDNA差減雜交和DD-RT-PCR技術(shù)，篩選得到許多在小鼠胚泡著床當(dāng)日(孕D5天)的著床部位和非著床部位之間，或著床前后的胚泡之問存

3、在特異性表達(dá)差異的基因的EST片段。但因人力、物力的限制，我們僅對(duì)其中很小一部分EST進(jìn)行了測(cè)序分析，鑒別到5個(gè)新的著床相關(guān)基因，并在克隆獲得這些基因的全長cDNA后在GenBank進(jìn)行了登錄，它們分別是：E4BP4(AY061760)、RGS2(AF432916)、ISP2(AF442819)、EMO一1(AY238936)和EMO-2(AY372183)。 經(jīng)GenBankBlast分析和相關(guān)文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，E4BP4是一種

4、受IL-3調(diào)節(jié)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，但未發(fā)現(xiàn)該基因與胚胎著床相關(guān)的研究報(bào)道；RGS2參與G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)以及T細(xì)胞增殖有關(guān)，其在著床中的作用未見有報(bào)道；ISP2是最近新發(fā)現(xiàn)的一種子宮組織特異基因，其表達(dá)受孕激素調(diào)節(jié)，并在胚胎著床期間呈特異性高表達(dá)，但其在胚胎著床中的作用尚有待于闡明；EMO一1與哺乳動(dòng)物Sec63基因有高度同源性，而Sec63參與多種蛋白前體分子的翻譯后加工；EMO-2是新基因，與人假定蛋白

5、MGC50372有一定同源性，因此沒有該基因的研究報(bào)道。MNSFβ是本實(shí)驗(yàn)室正在研究的另一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的著床相關(guān)因子，它是一種由抑制性T細(xì)胞合成的具有非特異性免疫抑制作用的淋巴因子，因其能抑制IL-4的分泌和Th2細(xì)胞的產(chǎn)生，所以推測(cè)其可能與母胎問免疫耐受的形成有關(guān)，但有待于研究證實(shí)。 因抗ISP2抗體和抗MNSFβ抗體尚未市場(chǎng)化，為了獲得這些蛋白分子的特異性抗體，用于其功能的研究，分別表達(dá)和純化了ISP2重組蛋白，以及MNSFp

6、—hCGβ口GST-MNSFp融合蛋白，并進(jìn)而以這些重組蛋白作為抗原，分別制備了抗ISP2抗體和抗MNSFp抗體。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室的其他研究人員也分別制備了抗EMO．1氨基末端肽段抗體(抗EMO．1NTP抗體)、抗EMO一1羧基末端肽段抗體(抗EMO一1CTP抗體)、抗EMO-2氨基末端肽段抗體(抗EMO-2NTP抗體)和抗EMO一1羧基末端肽段抗體(抗EMO-2CTP抗體)。這些抗體其后被用于免疫組化研究和體內(nèi)抗體封閉實(shí)驗(yàn)。

7、 應(yīng)用原位雜交或／和免疫組化技術(shù)，對(duì)E4BP4、RGS2、ISP2、EMO一1、EMO-2在胚胎著床期間小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在胚胎著床前、后的表達(dá)均存在特異性差異，但表達(dá)部位各有不同，而且EMO-2的高表達(dá)不依賴于胚胎的存在，用我們自己制備的抗ISP2抗體進(jìn)行的免疫組化結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的原位雜交結(jié)果也相一致。 為了進(jìn)一步了解ISP2、MNSFβ、EMO．1和EMO-2在胚胎著床中的作用，以及探討這些

8、著床相關(guān)因子是否能成為發(fā)展新型抗生育技術(shù)的潛在靶分子，我們?cè)谛∈篌w內(nèi)進(jìn)行了抗體封閉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，抗ISP2抗體、抗MNSFβ抗體、抗EMO-1抗體和抗EMO-2抗體都具有抑制小鼠胚胎著床的作用，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系。而本實(shí)驗(yàn)室此前應(yīng)用反義核酸技術(shù)進(jìn)行的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EMO．1和EMO-2的反義核酸對(duì)胚胎的著床也有明顯的抑制作用。我們分別收集了經(jīng)抗ISP2抗體和抗MNSFp抗體處理過和未經(jīng)抗體處理過的孕D5天小鼠子宮組織，然后通過免

9、疫組化研究，觀察抗ISP2抗體對(duì)小鼠子宮中uPA和MMP-9表達(dá)水平的影響，分析其抑制胚胎著床的可能機(jī)制：并應(yīng)用基因芯片技術(shù)，初步篩選出一些抗MNSFp抗體處理后在小鼠子宮組織表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因。 為了建立基因剔除小鼠模型的建模技術(shù)，為以后深入研究這些基因功能缺陷對(duì)胚胎著床的影響極其作用機(jī)制提供動(dòng)物模型，我們建立了具生殖系嵌合能力的C57BL／6J小鼠胚胎干細(xì)胞系，可用于今后制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因剔除動(dòng)物模型。 綜合