胚泡與子宮內(nèi)膜著床相關基因的篩選及其功能的研究.pdf

1、胚胎著床(又稱胚胎植入)是哺乳動物和人類生殖生理特有的一個環(huán)節(jié)，也是關系到妊娠成功與否的關鍵步驟。著床的順利進行有賴于胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育，即胚胎發(fā)育至胚泡階段并完成孵化過程，同時子宮也處于接受狀態(tài)，從而使得活化狀態(tài)的胚泡能在“著床窗口”極其有限的開放時間內(nèi)，及時與處于接受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜建立緊密聯(lián)系。這一顯得非常精致的協(xié)同發(fā)育過程受到來源于胚胎和母體子宮內(nèi)膜雙方的各種激素、生長因子、細胞因子、蛋白酶等激素類分子和非激素類分子的調(diào)控，

2、但其確切的分子機制仍不是十分清楚。 為了尋找新的與胚胎著床相關的非激素類分子，以更深入地了解胚胎著床的分子機制，并探尋進行生殖調(diào)控的新環(huán)節(jié)，本實驗室以小鼠為動物模型，分別收集了著床當日(孕D5天)小鼠著床部位和非著床部位子宮組織，以及著床前(孕D4天)和著床當日(孕D5天)小鼠胚泡，然后分別應用cDNA差減雜交和DD-RT-PCR技術(shù)，篩選得到許多在小鼠胚泡著床當日(孕D5天)的著床部位和非著床部位之間，或著床前后的胚泡之問存

3、在特異性表達差異的基因的EST片段。但因人力、物力的限制，我們僅對其中很小一部分EST進行了測序分析，鑒別到5個新的著床相關基因，并在克隆獲得這些基因的全長cDNA后在GenBank進行了登錄，它們分別是：E4BP4(AY061760)、RGS2(AF432916)、ISP2(AF442819)、EMO一1(AY238936)和EMO-2(AY372183)。 經(jīng)GenBankBlast分析和相關文獻查詢發(fā)現(xiàn)，E4BP4是一種

4、受IL-3調(diào)節(jié)的細胞核轉(zhuǎn)錄因子，但未發(fā)現(xiàn)該基因與胚胎著床相關的研究報道；RGS2參與G蛋白信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)節(jié)，與細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)以及T細胞增殖有關，其在著床中的作用未見有報道；ISP2是最近新發(fā)現(xiàn)的一種子宮組織特異基因，其表達受孕激素調(diào)節(jié)，并在胚胎著床期間呈特異性高表達，但其在胚胎著床中的作用尚有待于闡明；EMO一1與哺乳動物Sec63基因有高度同源性，而Sec63參與多種蛋白前體分子的翻譯后加工；EMO-2是新基因，與人假定蛋白

5、MGC50372有一定同源性，因此沒有該基因的研究報道。MNSFβ是本實驗室正在研究的另一個新發(fā)現(xiàn)的著床相關因子，它是一種由抑制性T細胞合成的具有非特異性免疫抑制作用的淋巴因子，因其能抑制IL-4的分泌和Th2細胞的產(chǎn)生，所以推測其可能與母胎問免疫耐受的形成有關，但有待于研究證實。 因抗ISP2抗體和抗MNSFβ抗體尚未市場化，為了獲得這些蛋白分子的特異性抗體，用于其功能的研究，分別表達和純化了ISP2重組蛋白，以及MNSFp

6、—hCGβ口GST-MNSFp融合蛋白，并進而以這些重組蛋白作為抗原，分別制備了抗ISP2抗體和抗MNSFp抗體。與此同時，本實驗室的其他研究人員也分別制備了抗EMO．1氨基末端肽段抗體(抗EMO．1NTP抗體)、抗EMO一1羧基末端肽段抗體(抗EMO一1CTP抗體)、抗EMO-2氨基末端肽段抗體(抗EMO-2NTP抗體)和抗EMO一1羧基末端肽段抗體(抗EMO-2CTP抗體)。這些抗體其后被用于免疫組化研究和體內(nèi)抗體封閉實驗。

7、 應用原位雜交或／和免疫組化技術(shù)，對E4BP4、RGS2、ISP2、EMO一1、EMO-2在胚胎著床期間小鼠子宮內(nèi)膜中的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在胚胎著床前、后的表達均存在特異性差異，但表達部位各有不同，而且EMO-2的高表達不依賴于胚胎的存在，用我們自己制備的抗ISP2抗體進行的免疫組化結(jié)果與文獻報道的原位雜交結(jié)果也相一致。 為了進一步了解ISP2、MNSFβ、EMO．1和EMO-2在胚胎著床中的作用，以及探討這些

8、著床相關因子是否能成為發(fā)展新型抗生育技術(shù)的潛在靶分子，我們在小鼠體內(nèi)進行了抗體封閉實驗，結(jié)果表明，抗ISP2抗體、抗MNSFβ抗體、抗EMO-1抗體和抗EMO-2抗體都具有抑制小鼠胚胎著床的作用，并呈劑量反應關系。而本實驗室此前應用反義核酸技術(shù)進行的體內(nèi)、外實驗結(jié)果表明，EMO．1和EMO-2的反義核酸對胚胎的著床也有明顯的抑制作用。我們分別收集了經(jīng)抗ISP2抗體和抗MNSFp抗體處理過和未經(jīng)抗體處理過的孕D5天小鼠子宮組織，然后通過免

9、疫組化研究，觀察抗ISP2抗體對小鼠子宮中uPA和MMP-9表達水平的影響，分析其抑制胚胎著床的可能機制：并應用基因芯片技術(shù)，初步篩選出一些抗MNSFp抗體處理后在小鼠子宮組織表達上調(diào)和下調(diào)的基因。 為了建立基因剔除小鼠模型的建模技術(shù)，為以后深入研究這些基因功能缺陷對胚胎著床的影響極其作用機制提供動物模型，我們建立了具生殖系嵌合能力的C57BL／6J小鼠胚胎干細胞系，可用于今后制備轉(zhuǎn)基因動物和基因剔除動物模型。 綜合