基于LCM技術(shù)的人子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因的篩選、克隆與鑒定.pdf

1、第一部分激光捕獲纖維切割與微量RNA的提取、純化、濃縮 目的：摸索一條可行的技術(shù)路線，運用激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)獲取無間質(zhì)混雜的人正常子宮內(nèi)膜腺管上皮細(xì)胞與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，用于進(jìn)行子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因差異表達(dá)的研究。 方法：采用LCM技術(shù)分別從正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織冰凍切片中捕獲子宮內(nèi)膜腺管上皮細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，提取微量RNA，并對微量RNA進(jìn)行純化及濃縮。設(shè)立對照實驗鑒定微量RNA的完整性，分光光度

2、計檢測RNA的濃度。 結(jié)果：分別從冰凍切片中捕獲子宮內(nèi)膜腺管上皮細(xì)胞280，000shootings，捕獲子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞196，000shootings。對照實驗Ⅰ、Ⅱ證實經(jīng)LCM后RNA完整性較好。確定了LCMshooting次數(shù)與可獲得RNA量間對應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論：通過LCM技術(shù)可以從冰凍切片中捕獲單一類型的目的細(xì)胞，此過程不會造成細(xì)胞RNA明顯降解，可以應(yīng)用于下游的實驗研究。 第二部分人子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因cD

3、NA片段的篩選、克隆與鑒定 目的：篩選、克隆與鑒定人子宮內(nèi)膜癌發(fā)病相關(guān)基因片段，探索子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子機(jī)制。 方法：采用熒光差異顯示技術(shù)(FDD-PCR)比較LCM捕獲細(xì)胞提取的正常子宮內(nèi)膜腺管細(xì)胞RNA與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RNA，篩選與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病特異相關(guān)的差異基因片段，克隆測序后反向Northern點雜交(使用擴(kuò)增的RNA)驗證差異片段的真假，對陽性片段利用Genebank進(jìn)行BLAST比對分析。 結(jié)果：共獲

4、得38條差異條帶，3條在正常子宮內(nèi)膜中高表達(dá)，35條在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)。對10條再回收差異條帶進(jìn)行克隆并測序，經(jīng)反向Northern點雜交鑒定獲得6條陽性差異基因片段。經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)：L1.1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7(CDK7)同源性為99％；L1.9與人類蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)抑制亞單位12A(PPP1R12A)同源性為99％；L1.21和L1.22與E1A激活基因1的抑制子(CERG)同源性為100％；L1.25、L1.26

5、與鋅轉(zhuǎn)運家族中的10號鋅轉(zhuǎn)運體(SLC39A10)同源性為98％以上。 結(jié)論：通過LCM技術(shù)與FDD-PCR技術(shù)的結(jié)合，獲得了與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病特異相關(guān)的基因片段。首次從基因水平發(fā)現(xiàn)了CDK7、PPP1R12A、CERG、SLC39A10與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的相關(guān)性，補(bǔ)充了對子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的分子機(jī)理的認(rèn)識。其中CDK7、CERG、SLC39A10可以作為新的子宮內(nèi)膜癌候選癌基因，PPP1R12A可以作為新的子宮內(nèi)膜癌候選抑癌基因來進(jìn)行

6、進(jìn)一步更深層次的研究。 第三部分CDK7蛋白表達(dá)與人子宮內(nèi)膜癌臨床特點的相關(guān)性研究 目的：研究CDK7在子宮內(nèi)膜癌組織中的蛋白表達(dá)情況及與子宮內(nèi)膜癌臨床特點的關(guān)系。 方法：采用免疫組化染色技術(shù)檢測CDK7在47例子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況，以10例正常子宮內(nèi)膜組織為對照研究并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：CDK7在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)率(74.5％)明顯高于其在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)率(10.0％)(P＜0.05)