小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜胚胎著床點(diǎn)及其旁組織microRNA差異表達(dá)及功能.pdf

1、目的:
　　子宮內(nèi)膜在著床窗期發(fā)生一系列變化以適應(yīng)胚胎植入，而胚胎的成功植入有賴于胚胎著床點(diǎn)與著床旁的基因表達(dá)差異。microRNA(miRNA)作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)器，已被證實(shí)在小鼠胚胎著床點(diǎn)與著床旁存在差異表達(dá)，參與胚胎著床的調(diào)控。為更好的了解miRNA對胚胎著床的調(diào)控作用及其機(jī)制，應(yīng)用microRNA芯片和基因芯片對小鼠著床窗口期（孕5天）子宮內(nèi)膜著床點(diǎn)及其旁組織差異表達(dá)的miRNAs和mRNAs進(jìn)行篩選，通過聯(lián)合分析芯片數(shù)據(jù)，

2、獲得著床點(diǎn)表達(dá)差異的信號通路，進(jìn)而找到起重要作用的關(guān)鍵miRNAs，為探討小鼠胚胎著床的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.標(biāo)本收集:收集小鼠孕5天子宮內(nèi)膜著床點(diǎn)和著床旁組織。
　　2.microRNA芯片分析:Trizol法提取樣本總RNA，將RNA用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat＃208032-A,Exiqon,Denmark)按說明書操作步驟進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的RN

3、A在miRCURYTMArray(Exiqon，Denmark)進(jìn)行雜交反應(yīng)。用Axon GenePix4000B芯片掃描儀進(jìn)行圖像掃描，GenePix pro V6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　3.基因芯片分析:Trizol法提取樣本總RNA，用Quick AmpLabeling Kit(Agilent)標(biāo)記，利用Agilent Gene Expression HybridizationKit(Agilent)進(jìn)行雜交，經(jīng)Gene

4、 Expression Wash Buffer(Agilent)洗滌后通過芯片掃描儀(Agilent)掃描圖像，最后利用Agilent Feature Extraction軟件分析數(shù)據(jù)。
　　4.熒光定量PCR驗(yàn)證:依照miRNA成熟序列設(shè)計(jì)對應(yīng)的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR上下游引物，采用U6作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證;隨機(jī)選取基因芯片數(shù)據(jù)中部分基因，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。
　　5.生物信息學(xué)分析:運(yùn)用miRNA靶基因

5、預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan、Pictar、miRBase檢索差異表達(dá)的miRNAs靶基因，再將所得靶基因與基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，與差異表達(dá)的基因求交集得到在小鼠孕5天子宮內(nèi)膜中的潛在靶基因。利用數(shù)據(jù)庫GO和KEGG對所得靶基因進(jìn)行功能分析，并進(jìn)行負(fù)相關(guān)運(yùn)算繪制負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而得到關(guān)鍵miRNAs。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片顯示:與著床旁相比，在著床點(diǎn)上調(diào)超過2倍及以上的miRNAs有30個(gè)，下調(diào)超過2倍及以上的

6、有42個(gè)。
　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示:隨機(jī)選取的miRNAs和mRNAs表達(dá)趨勢與芯片數(shù)據(jù)一致。
　　3.生物信息學(xué)分析:通過將Targetscan、Pictar、miRGen數(shù)據(jù)庫所得預(yù)測靶基因與基因芯片所得差異基因求交集得到差異表達(dá)miRNAs在子宮內(nèi)膜的潛在靶基因;將這些靶基因進(jìn)行功能分析得到著床點(diǎn)有20個(gè)信號通路上調(diào)、14個(gè)信號通路下調(diào);通過負(fù)相關(guān)運(yùn)算得到負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而篩選出關(guān)鍵miRNAs。
　　結(jié)

7、論:
　　1.芯片結(jié)果證實(shí)小鼠孕5天子宮內(nèi)膜著床點(diǎn)和著床旁組織存在差異表達(dá)的miRNAs(如上調(diào)的miR-21、miR-96、miR-30b，下調(diào)的miR-298)，提示miRNAs在胚胎著床過程中起一定的調(diào)控作用。
　　2.利用熒光定量PCR對部分差異表達(dá)的miRNAs和基因芯片數(shù)據(jù)中部分基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，證實(shí)芯片數(shù)據(jù)可靠。
　　3.經(jīng)生物信息學(xué)分析，得到差異表達(dá)的miRNAs的負(fù)相關(guān)靶基因和著床點(diǎn)上調(diào)的信號通路（