共振光散射在核酸及生物分析中的應(yīng)用.pdf

1、自從1953年沃生和克里克提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，核酸的研究進(jìn)入一個(gè)飛速的發(fā)展時(shí)期，如DNA重組技術(shù)等已被人們廣泛的關(guān)注，這些技術(shù)的突破大大的推動(dòng)了其他學(xué)科的發(fā)展。核酸定量分析在生命科學(xué)、生化藥物、臨床醫(yī)學(xué)以及食品檢驗(yàn)中有著重要的作用。目前有很多種測(cè)定核酸含量的方法，如使用較廣的探針技術(shù)法、吸光光度法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法以及新發(fā)展起來(lái)的共振光散射法(Resonance light scattering，RLS)。共振光散

2、射技術(shù)是一種建立在普通熒光分光光度計(jì)上的一種光散射分析技術(shù)。該技術(shù)方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，在分析化學(xué)領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用于核酸，蛋白質(zhì)，藥物及糖類(lèi)的分析測(cè)定。本文利用共振光散射研究了雙苯甲亞胺與核酸的作用機(jī)理。結(jié)合雙苯甲亞胺的熒光性質(zhì)，使用散射/熒光比率法技術(shù)，建立了較穩(wěn)定的核酸分析方法。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面： (1)Hoechst33258又名雙苯甲亞胺是雙苯并咪唑類(lèi)物質(zhì)的一種衍生物，是一種多環(huán)芳香族小分子物質(zhì)，具有一定的

3、電化學(xué)性，能夠特異性的與DNA相互作用，可作為DNA的電化學(xué)雜交指示劑。用共振光散射(RLS)光譜來(lái)證實(shí)雙苯甲亞胺與DNA之間存在靜電相互作用，此外，通過(guò)吸收光譜證實(shí)了雙苯甲亞胺與DNA之間的相互作用是嵌入作用；且雙苯甲亞胺與DNA的主要作用在A-T區(qū)域。 (2)熒光分光光度法和共振光散射法通常都只采用一種信號(hào)。對(duì)于有散射光信號(hào)與熒光信號(hào)共存的體系，我們希望能夠充分利用兩種信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)范圍，同時(shí)能夠更好的抵抗外界干

4、擾。因此，對(duì)于同時(shí)具有散射和熒光信號(hào)的生物微粒，可以通過(guò)測(cè)定一定波長(zhǎng)下不同的光學(xué)信號(hào)的比值，建立散射熒光比率分析法。本文基于脫氧核糖核酸(DNA)對(duì)有機(jī)染料雙苯甲亞胺(Hoechst33258)的共振光散射增強(qiáng)效應(yīng)和熒光淬滅效應(yīng)，建立了一種測(cè)定DNA的散射/熒光比率法。在pH4.56時(shí)，Hoechst33258在352nm處的散射增強(qiáng)和500nm處的熒光猝滅的比值與魚(yú)精子DNA(fsDNA)的濃度呈線性關(guān)系，線性范圍為0.04～1.61

5、μg ml-1，相關(guān)系數(shù)為0.9935，檢出限為5ng ml-1(3σ)。該方法簡(jiǎn)便、快速，在一定范圍染料濃度及外來(lái)干擾影響小，成功用于合成樣品中DNA的測(cè)定。 (3)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)是70年代發(fā)展起來(lái)的一種利用散射和熒光對(duì)細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性(細(xì)胞大小、DNA/RNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等)進(jìn)行定量、快速、客觀多參數(shù)相關(guān)檢測(cè)分析的新技術(shù)。另一方面，納米藥物具有許多優(yōu)點(diǎn)，如穩(wěn)定性好、對(duì)胃腸