麋鹿角補陽功效評價研究.pdf

1、麇鹿角為麇鹿Elaphurus davidianus Milne-Edwards的雄鹿已骨化脫落的角，入藥歷史悠久，是一種名貴稀缺的補益類中藥材，具有補陰、補陽、強筋骨、益精血的功效，用于虛勞贏弱，精血不足，陽痿，不孕，腰膝酸軟，筋骨疼痛等癥。本論文以麋鹿角為研究對象，開展了一系列對麋鹿角補陽功效的評價性研究。采用了氫化可的松致大鼠腎陽虛和“房事不節(jié)，勞倦過度”致雄性小鼠腎陽虛這兩個經(jīng)典模型，同時結(jié)合以分子細胞學角度，分別側(cè)重于不同方向

2、不同角度對麇鹿角補陽作用功效進行了評價及機理探究，以期為麇鹿角資源的開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)論簡述如下:
　　1.麋鹿角對氫化可的松致大鼠腎陽虛模型功效評價研究
　　本研究首先從一般狀況、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及血液中的環(huán)核苷酸四方面研究了麇鹿角不同部位對氫化可的松腎陽虛證大鼠的影響，初步探討其作用機制。在前期研究的基礎上，確定了每個給藥部位的最有效作用劑量。再通過復制氫化可的松致大鼠腎陽虛模型，采用UPL

3、C-QTOF-MS的代謝組學技術(shù)分析模型組和麇鹿角粉組、水提取物組、藥渣組給藥后大鼠血清代謝圖譜，尋找其作用于腎陽虛證大鼠血清代謝特征（包括生物標志物和代謝途徑）和整體代謝軌道，結(jié)合這兩部分的研究結(jié)果，系統(tǒng)地闡明麋鹿角不同部位對腎陽虛證大鼠的作用機制，為麇鹿角的補陽作用的活性部位和功效物質(zhì)基礎提供科學依據(jù)。
　　(1)生物效應體系評價研究
　　本實驗采用氫化可的松大鼠腎陽虛模型，將腎陽虛大鼠隨機分為8組:模型對照組，陽性對照

4、（金匱腎氣丸）組，麋鹿角原粉低、高劑量組，麋鹿角水提物低、高劑量組，麋鹿角藥渣低、高劑量組，另取8只健康大鼠作為空白對照組。實驗結(jié)果表明，與模型組比較，各給藥組和陽性對照組大鼠血清ATCH、CORT、T3、T4、T、cAMP/cGMP比值、1gG和lgM水平均明顯升高，胸腺、脾臟、腎臟指數(shù)顯著增加，E2和TSH水平明顯下降，體重下降趨勢得到糾正，表明各組均可不同程度促進腎陽虛大鼠體征的改善。
　　可見，腎陽虛證存在內(nèi)分泌、免疫功能

5、紊亂，麇鹿角不同部位能不同程度地調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、免疫功能，改善腎陽虛證大鼠癥狀，其補陽功效與其調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡功能密切相關(guān)。
　　(2)血清代謝組學研究
　　復制氫化可的松致腎陽虛證大鼠模型，基于UPLC-QTOF-MS技術(shù)對正常組、腎陽虛證模型組和麇鹿角各給藥治療組大鼠血清中小分子代謝物進行分析，采用主成分分析和正交偏最小乘判別分析法進行數(shù)據(jù)處理，尋找生物標志物和代謝通路，同時檢測血清中生化指標水平。結(jié)果表明:與正常組比較，

6、模型組大鼠血清中ATCH、CORT、T3、T4含量顯著降低，TSH含量明顯升高。這表明HPA，HPT軸出現(xiàn)了紊亂。麇鹿角粉組、水提組和藥渣組均可顯著提高血清中ATCH、CORT、T3、T4含量，降低TSH含量。確定了19個生物標記物，如前列腺素E1、L-甲狀腺素、甘油二酯、甘油三酯、?；o酶類、溶血磷脂類等內(nèi)源性生物標記物。涉及線粒體脂肪酸伸長代謝，甘油磷脂代謝，脂肪酸代謝，花生四烯酸代謝等代謝途徑。發(fā)現(xiàn)麇鹿角各給藥組對這些標記物具有顯

7、著地回調(diào)作用。
　　本研究揭示了麇鹿角各給藥組能通過影響相關(guān)代謝產(chǎn)物變化，來調(diào)節(jié)腎陽虛證大鼠體內(nèi)紊亂的代謝通路并使其像正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸，證明麇鹿角各給藥部位均能干預腎陽虛證大鼠癥狀。
　　2.麋鹿角對雄性小鼠房勞腎陽虛模型功效評價研究
　　麇鹿角傳統(tǒng)功效中滋陰壯陽、補肝腎、填精髓，主治虛勞贏弱，精血不足，陽痿，提示麋鹿角對機體性腺功能具有調(diào)節(jié)作用。
　　基于前期研究的基礎上，麇鹿角不同部位能不同程度地緩解氫化可的松致

8、小鼠腎陽虛下丘腦-垂體-性腺軸的紊亂。為了進一步探討麇鹿角不同部位對腎陽虛證模式生物的干預作用，本研究復制了“勞倦過度，房事不節(jié)”腎陽虛小鼠模型，通過分析麇鹿角不同部位對腎陽虛證小鼠的體重、生殖功能的影響。并基于前期研究的基礎上，采用UPLC-QTOF-MS的代謝組學技術(shù)分析正常組和模型組、水提組、醇提組、藥渣組和麋鹿角粉組給藥后小鼠血清代謝圖譜，尋找其干預腎陽虛證小鼠的生物標志物和代謝途徑，結(jié)合這兩部分的研究結(jié)果，探討了麇鹿角各給藥部

9、位對該模式生物的影響及作用機制，進一步為麇鹿角的補陽作用功效提供科學依據(jù)。
　　(1)生物效應體系評價研究
　　各給藥組與模型組相比:小鼠體重持續(xù)升高，麋鹿角醇提高、低劑量組及水提高、低劑量組有較明顯的升高體重的趨勢。麋鹿角各治療組均能提高小鼠腎臟、睪丸及附睪、包皮腺和精囊腺臟器指數(shù);捕捉潛伏期及交配潛伏期顯著縮短，捕捉次數(shù)及交配次數(shù)顯著增加，其中醇提高、低劑量組捕捉次數(shù)及交配次數(shù)呈顯著地升高趨勢，表明麇鹿角醇提取物能顯著地

10、提高腎陽虛小鼠的交配能力;小鼠體內(nèi)FSH、LH及T水平明顯升高;精子密度、精子活率、精子存活率顯著提高，精子畸形率顯著降低。
　　研究結(jié)果顯示，麇鹿角不同部位不同劑量均可使腎陽虛證的癥狀不同程度地向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。麇鹿角能明顯改善“房事不節(jié)，勞倦過度”致小鼠腎陽虛癥狀，其補陽功效主要通過改善其下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)功能密切相關(guān)。
　　(2)血清代謝組學研究
　　研究發(fā)現(xiàn)，麋鹿角各給藥組能不同程度地升高腎陽虛證小鼠睪丸及

11、附睪指數(shù)，但對睪丸的作用效果明顯優(yōu)于附睪，其中麇鹿角醇提組對提高腎陽虛小鼠睪丸及附睪指數(shù)均表現(xiàn)出較好的效果。
　　模型組較正常組和給藥組附睪管腔中精子密度相對要稀薄一些，精子數(shù)量明顯減少，管壁細胞排列分布疏松。研究表明麇鹿角各給藥組對能夠不同程度地緩解房勞腎陽虛對性器官造成的損害。
　　本實驗基于UPLC-QTOF/MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)38個潛在的生物標記物，這些生物標記物主要與甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸代謝、鞘脂類代謝等代謝途徑

12、有關(guān)。這些代謝通路在“房事不節(jié)，勞倦過度”腎陽虛證小鼠體內(nèi)發(fā)生紊亂，在給予麇鹿角不同部位后使其向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。
　　3.麋鹿角對小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM-3影響及作用機制研究
　　睪丸間質(zhì)細胞是睪丸中分泌睪酮的主要細胞，而睪酮在精子發(fā)生中起重要作用。前期研究表明，麋鹿角能有效地提高整體動物體內(nèi)睪酮水平。本實驗采用了超濾技術(shù)對麇鹿角總水提取物進行分離，獲得不同分子量段的麋鹿角樣品ML1-ML4，結(jié)合總水提取物及總醇提部位，將所獲得

13、的麋鹿角樣品作用于睪丸間質(zhì)細胞TM-3，對其有效部位進行初步篩選，并探討其對TM-3細胞的影響及作用機制。
　　(1)麇鹿角對TM-3細胞增殖的影響
　　取總醇提取物、總水提取物及水提取物不同分子量組分進行了對小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM-3的促增殖活性初步篩選。結(jié)果表明，總水提取物及ML1(10W＜MW)沒有表現(xiàn)出明顯的生長促進作用。ML2(10W＞MW＞1W)、ML3(1W＞MW＞3000)、ML4(3000＞MW)及總醇提取物

14、均表現(xiàn)出與陽性藥HCG類似的促增殖作用，ML2、ML3和ML4樣品濃度為62.5μg/ml是，增殖指數(shù)均超過120％，說明表現(xiàn)出顯著地增殖效果。
　　(2)麋鹿角對TM-3細胞分泌睪酮的影響
　　運用小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM-3體外培養(yǎng)技術(shù)，觀察麋鹿角水提不同部位及醇提取物對睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮能力的影響。結(jié)果表明麇鹿角水提取部位中ML1(10W＜MW)樣品對TM-3單位細胞內(nèi)、外分泌睪酮能力沒有明顯作用;ML2(10W＞MW＞

15、1W)和ML3(1W＞MW＞3000)樣品處理TM-3細胞后，單位細胞內(nèi)、外液睪酮水平均不同程度提高，且均在31μg/ml濃度時單位細胞內(nèi)、外液睪酮含量達到最高值;ML4(3000＞MW)樣品對單位細胞內(nèi)睪酮分泌呈一定的劑量依賴關(guān)系，在125μg/ml能明顯提高單位TM3細胞內(nèi)、外液睪酮水平。
　　(3)基于RT-PCR分析麋鹿角對TM-3細胞睪酮合成關(guān)鍵性酶mRNA表達的影響
　　結(jié)果表明，ML2(10W＞MW＞1W)、M

16、L3(1W＞MW＞3000)、ML4(3000＞MW)及總醇提取物對小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM-3睪酮合成的關(guān)鍵性酶P450scc、P450c17、3β-HSD、17β-HSD mRNA的表達均有不同程度的提高，其中ML3(1W＞MW＞3000)對各關(guān)鍵性酶mRN A的表達作用最明顯，這表明麇鹿角對TM-3細胞睪酮合成的最有效部位為麇鹿角總水提取物中分子量為1W＞MW＞3000。本研究篩選了麇鹿角作用于睪丸間質(zhì)細胞TM-3的的活性作用部位，為