厄貝沙坦對胞內(nèi)胞外氧化應(yīng)激引起胰島NIT-1細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、目的:胰島β細(xì)胞的損傷和凋亡是糖尿病發(fā)病的機(jī)理之一，引起機(jī)體胰島素分泌相對或絕對不足從而出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。與其他組織細(xì)胞相比，胰島β細(xì)胞的抗氧化能力水平低。有研究報(bào)道高糖、高脂、炎性因子、鏈脲佐菌素、過氧化氫等均可引起胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。隨著對糖尿病發(fā)病機(jī)制的不斷研究，有研究發(fā)現(xiàn)，在胰島β細(xì)胞的微生存環(huán)境中，高糖、高脂、炎性因子等在引起胰島β細(xì)胞凋亡或壞死的同時(shí)伴有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin Angiotensin Syste

2、m，RAS)的激活。而目前已有大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)在人、大鼠、小鼠、犬類等多種動物的胰腺上均存在合成血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的獨(dú)立體系，并在胰腺局部發(fā)揮重要的調(diào)控作用。胰腺局部的RAS具有自身的特點(diǎn)，不依賴于腎臟，可以自身合成、釋放，并通過胞內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的方式來發(fā)揮對細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡，組織炎癥及纖維化等的生理及病理生理作用。近年有循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，使用血管緊張素受體拮抗劑(Angiotens

3、inreceptor blocker, ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin-convertingenzyme inhibitor, ACEI)，可以有效降低具有高危因素（肥胖、心血管疾病、吸煙等）患者新發(fā)2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，其具體機(jī)制目前尚不清楚。本課題組的前期研究也證實(shí)血管緊張素受體1（AT1受體）拮抗劑厄貝沙坦可以拮抗高糖環(huán)境中胰島β細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制與抑制AT1R、AngⅡ mRNA表達(dá)，阻斷RAS通路，以及

4、抗氧化和下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3mRNA的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選擇NOD小鼠胰島細(xì)胞瘤NIT-1胰島細(xì)胞，它具有胰島β細(xì)胞的功能，體外培養(yǎng)以存活，并通過不同途徑來源的氧化應(yīng)激因素鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)及過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)胰島NIT-1細(xì)胞損傷，建立胰島細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氧化損傷模型，進(jìn)一步進(jìn)行厄貝沙坦對凋亡胰島NIT-1細(xì)胞觀察研究。本研究內(nèi)容分為兩部分:第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細(xì)

5、胞損傷模型，第二部分是厄貝沙坦對鏈脲佐菌素及過氧化氫誘導(dǎo)胰島NIT-1細(xì)胞凋亡的影響，為臨床開展糖尿病的病因治療、指導(dǎo)糖尿病的防治提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　材料和方法:本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為兩部分，第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細(xì)胞損傷模型:選取對數(shù)生長期的NOD小鼠胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞，分別加入STZ和H2O2干預(yù)。第二部分是根據(jù)第一部分建立所得的NIT-1胰島β細(xì)胞凋亡模型基礎(chǔ)上，在上部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上分別選取終濃度為2mm

6、ol/LSTZ、300μmol/L的H2O2干預(yù)細(xì)胞30min，棄干預(yù)液，分別加入不同濃度(0.1、0.01、0.001mmol/L及0mmo/L即無厄貝沙坦的陽性組)的厄貝沙坦培養(yǎng)液，按厄貝沙坦?jié)舛确纸M。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求，第一部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:收集各組細(xì)胞，采用Hochest33342熒光染色法觀察各組細(xì)胞的凋亡形態(tài)，流式凋亡檢測技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，在所測得流式細(xì)胞凋亡率的基礎(chǔ)上，選擇誘導(dǎo)胰島NIT-1細(xì)胞凋亡率適中的STZ及H2O

7、2濃度組即（B組和D組）繼續(xù)進(jìn)行RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡因子Caspase-3 mRNA的表達(dá)。第二部分，以2mmol/LSTZ及300μmol/LH2O2誘導(dǎo)胰島NIT-1細(xì)胞凋亡，Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀技術(shù)凋亡各組細(xì)胞的凋亡率，CellROX流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測各組細(xì)胞活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS）的含量，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測各組細(xì)胞AT1、Caspa

8、se-3、NADPH mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:第一部分胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型各組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①Hochest33342熒光染色下各組細(xì)胞在熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的描述:F組細(xì)胞的彌漫均勻淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞胞膜完整，A組細(xì)胞著色與細(xì)胞形態(tài)大致與F組相近，B組可見部分細(xì)胞細(xì)胞核成亮藍(lán)色熒光，胞核濃縮，細(xì)胞形態(tài)大小不一，C組和E組細(xì)胞熒光亮度不均一、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、胞膜不完整，細(xì)胞碎片較多。D組

9、細(xì)胞部分細(xì)胞成強(qiáng)藍(lán)色熒光，并見細(xì)胞形態(tài)大小不一，有細(xì)胞碎片。②Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果:A、B、C、D、E5組細(xì)胞凋亡率與F組比較，A、B、C、D、E5組細(xì)胞凋亡率顯著升高P＜0.05。③RT-PCR技術(shù)檢測B組D組及F組細(xì)胞Caspase-3的相對表達(dá)量結(jié)果:與F組比較，B組和D組的胰島NIT-1細(xì)胞Caspase-3增高(P＜0.05)。第二部分厄貝沙坦對STZ及H2O2誘導(dǎo)胰島NIT-1細(xì)胞

10、凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率:G1、G2、G3組的細(xì)胞凋亡率均少于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的細(xì)胞凋亡率少于H4組，且細(xì)胞凋亡率隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸減少。②CellROX流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS相對含量的表達(dá):G1、G2、G3組的細(xì)胞ROS相對含量均低于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P＜0.05)

11、，且細(xì)胞ROS的相對含量也隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸減少。③RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞基因的相對表達(dá)量結(jié)果:G1、G2、G3組的細(xì)胞ROS相對含量均少于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P＜0.05)，厄貝沙坦組的Caspase-3、NADPH mRNA的表達(dá)量下降(P＜0.05)，AT1 mRNA的表達(dá)量也呈下降趨勢(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、一定濃度的STZ及H2O